Summary
Este protocolo discute a dissecção ao vivo de
Abstract
Elucidar os mecanismos de transporte axonal tem se mostrado muito importante na determinação de como defeitos no transporte de longa distância afetam diferentes doenças neurológicas. Defeitos neste processo essencial pode ter efeitos prejudiciais no funcionamento neuronal e desenvolvimento. Nós desenvolvemos um protocolo de dissecação que é projetado para expor os
Protocol
1. Preparação dos Reagentes
- Prepare a preparação buffer de dissecção, adicionando os seguintes compostos: 128 mM NaCl, 1mM EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mM KCl, HEPES 5mM, sacarose e 36 mM em 1000 mL PH, para 7,2 e filtro de esterilizar.
2. Preparação para o Dissection
- Cubo Siligard: O gel é cortado para cerca de uma polegada de largura, 1 cm de comprimento e cerca de um centímetro de altura. O cubo de gel é colocado numa lâmina de vidro durante a dissecção. Cubos podem ser usados mais de uma vez.
- Pinos: Pinos usados para dissecção precisa ser mais curta. A parte inferior afiada de pinos minutien funciona melhor na dissecção.
- Precisa de uma tesoura afiada primavera microdissecção.
- Precisa de duas pinças de ponta fina.
3. Coleta de larvas
- Wandering 3 de larvas que são expressão de uma proteína GFP vesícula tagged são coletados em uma placa de Petri.
- As larvas são lavados em água deionizada para se livrar de todos os alimentos.
4. Dissecção ao vivo de larvas
- A larva é transferido para o cubo gel dissecção numa lâmina de vidro. Larva é imerso em tampão dissecção.
- Larva é pined no anterior e posterior com dois pinos de bem com o lado dorsal para cima.
- Com uma tesoura de microdissecção, um pequeno corte é feito na linha média, perto da extremidade posterior. A partir desta incisão um corte é feito através do anterior. Usando dois pinos, pino a cutícula corte nas bordas laterais.
- Adicionar uma gota de dissecar buffer. Remova cuidadosamente o intestino, intestinos e órgãos de gordura com uma pinça. A maioria destes tecidos normalmente exsudado durante o corte dorsal.
- Substitua o tampão com tampão dissecar fresco. A larva nunca deve ser seco e deve ser constantemente em dissecar buffer.
- Incubações utilizando marcadores em MitoTracker vivo ou Lyso Tracker é feito neste momento, diluindo-se no marcador o vivo em tampão dissecção. Após a incubação da vivo no marcador lavar a larva dissecados várias vezes (5 lava rápido) usando tampão dissecar fresco.
- Depois de substituir a última lavagem empurrar os pinos para o syligard e imediatamente lamela. As larvas está agora pronto para observação.
5. Imagens ao vivo de larvas dissecadas
- Coloque a lamela e gel para o palco microscópio e imagem usando um microscópio invertido.
- Nós usamos uma lente de 100x para vesículas imagem marcada dentro larval nervos segmentares. GFP expressão no corpos celulares do gânglio ventral é o primeiro avaliado antes de nervos segmentares são gravadas. Se a coloração GFP robusta é observada em corpos celulares no gânglio ventral, os nervos são, então, fotografado e usado para avaliação.
- Utilizando um sistema de visualização dupla com filtros para CFP / YFP ou RFP / YFP e software de visualização dividida que pode, simultaneamente, duas proteínas com a tag de imagem in vivo.
6. Resultados representante
Figura 1:. A imagem representativa mostrando muitas vesículas axonal em muitas faixas axonal dentro de um nervo segmentar larval Observe as bolhas de GFP, o que representa acúmulo axonal.
Figura 2: A imagem representativa mostrando uma única faixa axonal com muitas vesículas axonal dentro de um nervo segmentar larval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Na imagem in vivo de transporte dentro das vesículas sinápticas nervos Drosophila larval segmentar é uma ferramenta poderosa para estudar os mecanismos de transporte axonal. Nós já usou este protocolo para avaliar a dinâmica de transporte dentro nervos larval expressar repete expandiu polyQ para elucidar como a expansão de repetições afeta a dinâmica de transporte vesícula 3. Usando este protocolo a velocidade do movimento das vesículas pode ser determinada pela conversão dos fluxos de vídeo a um quimógrafo. Usando a genética, a GFP transporte vesicular pode ser visualizado dentro de um único axônio ou dentro de vários axônios usando um driver GAL4 específica para conduzir a expressão de GFP. Além disso, a dinâmica de transporte também pode ser observado em larvas portadores de mutações de genes específicos. Mais dois vesículas marcadas com GFP diferentes variantes (PCP ou RFP) podem ser visualizados simultaneamente.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
SG é apoiado por fundos da Universidade Estadual de Nova York em Buffalo e de John R. Oishei Foundation.
MK foi apoiado por um Student Research Award por Curca na UB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
