Summary
Este protocolo describe la disección en vivo de
Abstract
Elucidar los mecanismos de transporte axonal ha demostrado ser muy importante para determinar cómo los defectos en el transporte de larga distancia afecta a diferentes enfermedades neurológicas. Los defectos en este proceso esencial puede tener efectos perjudiciales en el funcionamiento neuronal y el desarrollo. Hemos desarrollado un protocolo de disección que está diseñado para exponer los
Protocol
1. Preparación de los reactivos
- Prepare la preparación de amortiguación disección mediante la adición de los siguientes compuestos: 128 mM NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM de MgCl 2, 2 mM KCl, HEPES 5 mM y 36 mM de sacarosa en 1000 ml, el pH a 7,2 y el filtro de esterilización.
2. Preparación para la disección
- Cubo Siligard: El gel se corta a aproximadamente una pulgada de ancho, una pulgada de largo y aproximadamente 1 cm de alto. El cubo de gel se coloca en un portaobjetos de vidrio durante la disección. Los cubos se pueden utilizar más de una vez.
- Pins: pins utilizados para la disección debe ser muy corto. La parte inferior de pasadores fuerte minutien funciona mejor en la disección.
- Necesidad de una tijeras afiladas primavera microdisección.
- Necesita dos pinzas de punta fina.
3. Recolección de larvas
- Vagando 3 de larvas que son expresión de una proteína GFP etiquetados vesículas se recogen en una placa de Petri.
- Las larvas se lavan con agua desionizada para deshacerse de todos los alimentos.
4. La disección en vivo de larvas
- Una larva se transfiere al cubo de gel de la disección de un portaobjetos de vidrio. Larva se encuentra inmersa en un tampón de disección.
- Larva se consumía en el anterior y posterior uso de dos pines muy bien con el dorso hacia arriba.
- El uso de tijeras de microdisección, una pequeña incisión en la línea media cerca del extremo posterior. A partir de esta incisión se hace una incisión a través de la anterior. El uso de dos pines, el pin de la cutícula corte en los bordes laterales.
- Añadir una gota de la disección de buffer. Retire con cuidado el intestino, los intestinos y los órganos de grasa con fórceps. La mayoría de estos tejidos que normalmente se escurre durante el corte dorsal.
- Vuelva a colocar el tampón con el tampón fresco de disección. La larva no debe estar seca y deben estar constantemente en la disección de amortiguamiento.
- Incubaciones con los marcadores en vivo o MitoTracker LysoTracker se llevan a cabo en este momento, diluyendo el marcador en vivo en un tampón de disección. Después de la incubación de los marcadores en vivo lavar la larva diseccionado varias veces (cinco lavados rápidos) con tampón fresco de disección.
- Después de reemplazar el último lavado, empujar las clavijas en el syligard y cubreobjetos de inmediato. Las larvas ya está listo para la observación.
5. Imágenes en vivo de larvas disecadas
- Coloque el cubreobjetos y gel en la platina del microscopio y la imagen mediante un microscopio invertido.
- Utilizamos un lente de 100x a las vesículas de imagen etiquetada dentro de las larvas nervios segmentarios. La expresión de GFP en los cuerpos celulares del ganglio ventral se evalúa en primer lugar antes de los nervios segmentarios se va a examinar. Si la tinción GFP robusta que se observa en los cuerpos celulares en el ganglio ventral, los nervios están a continuación, imágenes y para su evaluación.
- El uso de un sistema de visión dual con filtros para PPC / YFP o RFP YFP / software y división de opiniones que puede, simultáneamente, imágenes de dos proteínas marcadas en vivo.
6. Resultados representante
Figura 1:. Una imagen representativa que muestra muchas vesículas axonal en muchas pistas axonal en el nervio segmentario larvas Nota las manchas de la GFP, lo que representa la acumulación axonal.
Figura 2: Una imagen representativa que muestra una pista única axonal con muchas vesículas axonal en el nervio segmentario larval.
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Discussion
Imágenes in vivo de transporte de vesículas sinápticas en Drosophila nervios larvas segmentaria es una poderosa herramienta para el estudio de los mecanismos en el transporte axonal. Hemos utilizado anteriormente este protocolo para evaluar la dinámica de transporte dentro de los nervios larvas expresar ampliado repite polyQ para dilucidar cómo la expansión de repeticiones afectan a la dinámica del transporte de vesículas 3. El uso de este protocolo la velocidad de movimiento de la vesícula puede ser determinado mediante la conversión de los flujos de vídeo a un quimógrafo. Utilizando la genética, el transporte de vesículas GFP se puede visualizar en un solo axón o dentro de varios axones mediante el uso de un determinado GAL4 conductor a conducir la expresión de GFP. Además, la dinámica del transporte también se observa en las larvas portadoras de mutaciones de genes específicos. Otros dos vesículas marcadas con GFP variantes diferentes (PPC o RFP) se puede visualizar de forma simultánea.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.
MK fue apoyado por un Premio de Investigación de Estudiantes de la UB por curca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
