Summary
इस प्रोटोकॉल का जीना विच्छेदन चर्चा
Abstract
Axonal परिवहन के तंत्र elucidating निर्धारण कैसे लंबी दूरी की परिवहन में दोष अलग स्नायविक रोगों को प्रभावित करने में बहुत महत्वपूर्ण हो दिखाया गया है. यह आवश्यक प्रक्रिया में दोष neuronal कामकाज और विकास पर हानिकारक प्रभाव हो सकता है. हम एक विच्छेदन प्रोटोकॉल को बेनकाब करने के लिए डिज़ाइन किया गया है विकसित किया है
Protocol
1. अभिकर्मकों की तैयारी
- विच्छेदन बफर तैयारी 7.2 फिल्टर और बाँझ 128 मिमी NaCl, 1mm EGTA, 4 मिमी 2 MgCl, 2mm KCl, 5mm HEPES, और 1000 एमएल पीएच, में 36 मिमी Sucrose: निम्नलिखित यौगिकों को जोड़कर तैयार करें .
2. विच्छेदन के लिए तैयार
- Siligard क्यूब: लगभग एक इंच चौड़ी, 1 इंच लंबी और के बारे में उच्च 1cm जेल काट रहा है. जेल क्यूब विच्छेदन के दौरान एक गिलास स्लाइड पर रखा गया है. Cubes एक बार से अधिक इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पिन: विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया पिन के अतिरिक्त कम करने की आवश्यकता है. minutien पिनों की तेज नीचे भाग विच्छेदन में सबसे अच्छा काम करता है.
- एक तेज microdissection वसंत कैंची की जरूरत है.
- दो ठीक इत्तला दे दी संदंश की आवश्यकता है.
3. लार्वा के संग्रह
- भटक 3 Rd instar लार्वा कि एक GFP टैग पुटिका प्रोटीन व्यक्त कर रहे हैं एक पेट्री डिश पर एकत्र कर रहे हैं.
- लार्वा विआयनीकृत जल में धो रहे हैं सभी खाद्य छुटकारा.
4. लार्वा के लाइव विच्छेदन
- लार्वा एक गिलास स्लाइड पर विच्छेदन जेल क्यूब को सौंप दिया है. लार्वा विच्छेदन बफर में डूब जाता है.
- लार्वा पूर्वकाल और कूल्हों पृष्ठीय पक्ष के साथ दो ठीक पिन अप का उपयोग कर pined है.
- Microdissection कैंची का प्रयोग, एक छोटे से कट पीछे के अंत के पास midline पर किया जाता है. इस चीरा से एक कट पूर्वकाल के माध्यम से किया जाता है. दो पिनों का प्रयोग, पार्श्व किनारों पर कटौती छल्ली पिन.
- बफर विदारक की एक बूंद जोड़ें. ध्यान संदंश के साथ पेट, आंतों और वसा शरीर को हटा दें. इन ऊतकों के अधिकांश आम तौर पर पृष्ठीय काटने के दौरान बाहर रिसना.
- ताजा विदारक बफर के साथ बफर बदलें. लार्वा सूखी कभी नहीं हो सकता है और लगातार बफर विदारक में होना चाहिए.
- Incubations उपयोग vivo में मार्करों MitoTracker या LysoTracker में इस समय विच्छेदन बफर में vivo मार्कर में गिराए द्वारा किया जाता है. Vivo मार्कर में की ऊष्मायन बाद dissected लार्वा कई बार (5 त्वरित washes) ताजा विदारक बफर का उपयोग कर धो लो.
- जगह के बाद पिछले धोने syligard और तुरंत coverslip में पिन धक्का. लार्वा अब अवलोकन के लिए तैयार है.
5. Dissected लार्वा लाइव इमेजिंग
- Coverslip और खुर्दबीन मंच और एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग कर छवि पर जेल रखें.
- हम लार्वा कमानी नसों के भीतर छवि टैग vesicles के लिए एक 100x लेंस का उपयोग करें. GFP अभिव्यक्ति उदर नाड़ीग्रन्थि सेल शरीर में पहली बार पहले कमानी नसों imaged हैं मूल्यांकन किया है. यदि मजबूत GFP धुंधला वेंट्रल नाड़ीग्रन्थि में सेल शरीर में मनाया जाता है, नसों और फिर imaged मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया कर रहे हैं.
- CFP / YFP या आरएफपी / YFP के लिए फिल्टर और विभाजित दृश्य सॉफ्टवेयर हम एक साथ छवि कर सकते हैं vivo में दो टैग प्रोटीन के साथ एक दोहरी दृश्य प्रणाली का उपयोग करना.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1: एक प्रतिनिधि एक लार्वा कमानी तंत्रिका के भीतर कई axonal पटरियों पर कई axonal vesicles दिखा छवि GFP की blobs के नोट, axonal राशि का प्रतिनिधित्व.
चित्रा 2: एक प्रतिनिधि लार्वा कमानी तंत्रिका के भीतर कई axonal vesicles के साथ एक एकल axonal ट्रैक दिखा छवि.
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Discussion
ड्रोसोफिला लार्वा कमानी नसों के भीतर synaptic पुटिका परिवहन के vivo इमेजिंग में axonal परिवहन तंत्र के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है . हम पहले इस प्रोटोकॉल का उपयोग किया है लार्वा विस्तार polyQ दोहराता को व्यक्त करने के लिए स्पष्ट कैसे दोहराता के विस्तार पुटिका 3 परिवहन की गतिशीलता को प्रभावित नसों के भीतर परिवहन गतिशीलता का मूल्यांकन करने के लिए. इस प्रोटोकॉल का प्रयोग पुटिका आंदोलन के वेग एक kymograph वीडियो धाराओं में कनवर्ट करके निर्धारित किया जा सकता है. आनुवंशिकी का प्रयोग, GFP पुटिका परिवहन एक एकल अक्षतंतु के भीतर या कई axons के भीतर कल्पना GFP की अभिव्यक्ति ड्राइव के लिए एक विशिष्ट GAL4 ड्राइवर का उपयोग कर के द्वारा किया जा सकता है. इसके अलावा परिवहन की गतिशीलता लार्वा विशिष्ट जीन म्यूटेशनों ले जाने में भी देखा जा सकता है. इसके अलावा दो अलग GFP वेरिएंट (CFP या आरएफपी) के साथ टैग vesicles के साथ देखे जा सकते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
एसजी से भैंस पर न्यूयॉर्क के राज्य विश्वविद्यालय और जॉन आर Oishei फाउंडेशन से धन के द्वारा समर्थित है.
एम यूबी पर एक छात्र CURCA द्वारा अनुसंधान पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
