Summary
Detta protokoll behandlar leva dissektion av
Abstract
Belysa mekanismerna för axonal transport har visat sig vara mycket viktigt för att avgöra hur fel i långväga transporter påverkar olika neurologiska sjukdomar. Defekter i denna viktiga process kan ha skadliga effekter på neuronal funktion och utveckling. Vi har utvecklat en dissektion protokoll som utformats för att utsätta
Protocol
1. Beredning av reagenser
- Förbered beredningen dissektion buffert genom att lägga till följande föreningar: 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 mm MgCl 2, 2mm KCl, 5mm HEPES och 36 mm Sackaros i 1000 ml, PH till 7,2 och filtrera sterilisera.
2. Förberedelse för Dissection
- Siligard kub: Gelen är nedskurna till ungefär en tum bred, 1 cm lång och ca 1 cm hög. Gelen kuben är placerad på en glasplatta under dissektion. Kuber kan användas mer än en gång.
- Pins: Pins används för dissektion behöver vara extra kort. Den skarpa nedre delen av minutien stift fungerar bäst i dissekering.
- Behöver du en vass sax microdissection våren.
- Behöver två fina tippas pincett.
3. Insamling av larver
- Wandering 3: e INSTAR larver som uttrycker en GFP taggad vesikelproteinet samlas på en petriskål.
- Larver tvättas i avjoniserat vatten för att bli av all mat.
4. Live dissektion av larver
- En larv överförs till dissekering gelen kuben på en glasplatta. Larv är nedsänkt i dissektion buffert.
- Larv är trånade på främre och bakre med två fina pins med ryggsidan uppåt.
- Använda microdissection sax, är en liten skär som gjordes vid mittlinjen nära den bakre änden. Ur detta snitt ett snitt görs genom att den främre. Med hjälp av två stift, stift snittet nagelbanden på sidokanter.
- Tillsätt en droppe dissekera buffert. Ta försiktigt bort tarmen, tarmar och fett organ med pincett. De flesta av dessa vävnader gyttja normalt ut under rygg-klippning.
- Ersätt bufferten med färska dissekera buffert. Larven ska aldrig vara torrt och bör ständigt vara i dissekera buffert.
- Inkubationer med in vivo markörer MitoTracker eller LysoTracker sker vid denna tid, genom att späda ut in vivo markören i dissektion buffert. Efter inkubering av in vivo markör tvätta dissekerade larven flera gånger (5 snabba tvättar) med färska dissekera buffert.
- Efter byte av sista tvättningen tryck stiften i syligard och omedelbart täckglas. Larverna är nu klar för observation.
5. Live avbildning av dissekerat larver
- Placera täckglas och gel på mikroskop scenen och bilden med ett inverterat mikroskop.
- Vi använder en 100x objektiv till bilden taggade vesikler inom larver segmentell nerver. GFP uttryck i cellen organ ventrala ganglion är först utvärderas innan segmentella nerver avbildas. Om robust GFP färgning observeras i cellen organ i ventrala ganglion, är nerverna sedan avbildas och används för utvärdering.
- Med hjälp av en Dual View-system med filter för den gemensamma fiskeripolitiken / YFP eller RFP / YFP och delad vy programvara kan vi samtidigt bilden två taggade proteiner in vivo.
6. Representativa resultat
Figur 1:. En representant bild som visar många axonal blåsor på många axonal spår inom en larv segmentell nerv Notera blobbar av GFP, som representerar axonal ansamlingar.
Figur 2: En representant bild som visar en axonal spår med många axonal blåsor inom en larv segmentell nerv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo avbildning av synaptiska vesikler transporter inom Drosophila larver segmentella nerver är ett kraftfullt verktyg för att studera de mekanismer i axonal transport. Vi har tidigare använt detta protokoll för att utvärdera transporter dynamiken på larver nerver som uttrycker expanderat polyQ upprepar att belysa hur expansionen av upprepar att påverka dynamiken i vesikler transporter 3. Med hjälp av detta protokoll hastigheten i vesikler rörelse kan bestämmas genom att omvandla videoströmmar till en kymograph. Använda genetik, kan GFP vesikler transporter visualiseras i ett enda axon eller inom flera axoner via ett speciellt GAL4 föraren att köra ett uttryck av GFP. Dessutom dynamiken i transporten kan också iakttas i larver bär mutationer för specifika gener. Ytterligare två blåsor taggade med olika GFP varianter (GFP eller RFP) kan samtidigt visualiseras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
SG stöds av medel från State University of New York at Buffalo och från John R. Oishei Foundation.
MK fick stöd av en Student Forskning Award av CURCA på UB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
