Summary
Ce protocole traite de la dissection en direct de
Abstract
Élucider les mécanismes du transport axonal a montré pour être très important pour déterminer comment les défauts de transport de longue distance affectent différentes maladies neurologiques. Défauts dans ce processus essentiel peut avoir des effets néfastes sur le fonctionnement neuronal et le développement. Nous avons développé un protocole de dissection qui est conçu pour exposer les
Protocol
1. Préparation des réactifs
- Préparer la préparation du tampon de dissection en ajoutant les composés suivants: 128 mM de NaCl, 1 mM EGTA, 4 mM de MgCl2, 2 mM de KCl, HEPES 5 mM, et 36 mM de saccharose en 1000 ml, pH à 7,2 et stériliser par filtration.
2. Préparation de la dissection
- Cube Siligard: Le gel est coupé à environ un pouce de largeur, 1 cm de long et environ 1cm de haut. Le cube de gel est placé sur une lame de verre lors de la dissection. Cubes peuvent être utilisés plusieurs fois.
- Pins: Pins utilisés pour la dissection doit être extra court. La partie inférieure forte de broches minutien fonctionne mieux dans la dissection.
- Besoin d'une paire de ciseaux pointus de printemps de microdissection.
- Besoin deux beaux pince à pointe.
3. Collecte des larves
- Errant 3 e stade larvaire qui sont expression d'une protéine GFP vésicules marquées sont recueillies sur une boîte de Pétri.
- Les larves sont lavées à l'eau déminéralisée pour se débarrasser de tous les aliments.
4. Une dissection en direct des larves
- Une larve est transféré au cube de gel de dissection sur une lame de verre. Larve est immergé dans un tampon de dissection.
- Larve se languissait à l'antérieur et postérieur au moyen de deux broches fines avec la face dorsale en place.
- Avec des ciseaux de microdissection, une petite incision est faite sur la ligne médiane à proximité de l'extrémité postérieure. A partir de cette incision une coupe est faite par le biais à l'antérieur. En utilisant deux broches, la broche la cuticule couper sur les bords latéraux.
- Ajouter une goutte de dissection tampon. Retirer délicatement le tube digestif, les intestins et corps gras avec une pince. La plupart de ces tissus normalement suinter pendant la coupe dorsale.
- Remplacer le tampon avec un tampon de dissection douce. La larve ne doit jamais être sec et doit être constamment à disséquer tampon.
- Les incubations utilisant des marqueurs in vivo ou Mitotracker Lysotracker sont faites à cette époque, en diluant l'un marqueur in vivo dans un tampon de dissection. Après l'incubation des marqueurs in vivo dans le lavage de la larve disséquée à plusieurs reprises (5 lavages rapides) à l'aide du tampon frais de dissection.
- Après avoir remplacé le dernier lavage pousser les goupilles dans les syligard et immédiatement lamelle. Les larves est maintenant prêt pour l'observation.
5. Imagerie en temps réel des larves disséquées
- Placez la lamelle et gel sur la platine du microscope et de l'image à l'aide d'un microscope inversé.
- Nous utilisons un objectif 100x à des vésicules Tagged Image au sein des larves nerfs segmentaires. Expression de la GFP dans les corps cellulaires du ganglion ventral est d'abord évaluée avant que les nerfs segmentaires sont imagés. Si coloration GFP robustes est observée dans les corps cellulaires dans le ganglion ventral, les nerfs sont ensuite numérisés et utilisés pour l'évaluation.
- En utilisant un système Dual View avec des filtres pour CFP / YFP ou DP / YFP et logiciels affichage fractionné, nous pouvons simultanément image en deux protéine marquée in vivo.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1:. Une image représentative montrant de nombreuses vésicules axonales sur de nombreuses pistes axonale au sein d'un nerf segmentaire larvaires Notez les blobs de la GFP, ce qui représente des accumulations axonale.
Figure 2: Une image représentative montrant une seule piste axonale avec de nombreuses vésicules axonales au sein d'un nerf segmentaire larvaires.
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Discussion
L'imagerie in vivo du transport des vésicules synaptiques dans les nerfs des larves de drosophile segmentaire est un outil puissant pour étudier les mécanismes de transport axonal. Nous avons déjà utilisé ce protocole pour évaluer la dynamique de transport dans les nerfs des larves exprimer élargi répète polyQ à élucider comment l'expansion de répétitions affecter la dynamique des trois transport vésiculaire. En utilisant ce protocole la vitesse de déplacement des vésicules peut être déterminé par la conversion des flux vidéo à un kymographe. En utilisant la génétique, transport vésiculaire GFP peuvent être visualisées dans un seul axone ou dans plusieurs axones en utilisant un pilote spécifique GAL4 pour conduire l'expression de la GFP. En outre, la dynamique du transport peut également être observée chez les larves porteuses de mutations des gènes spécifiques. En outre deux vésicules taggés avec des variantes différentes GFP (CFP ou DP) peuvent être visualisées simultanément.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
SG est soutenu par des fonds de l'Université d'État de New York à Buffalo et de la Fondation John R. Oishei.
MK a été soutenu par une bourse de recherche par curca UB.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 Pair Micro Dissection Scissors | Fine Science Tools | Spring scissors – 6mm blade. 0.125 mm tip diameter | |
| 2 Pair Forceps | Fisher Scientific | Fisherbrand Dissecting Micro-Adson serrated tip forceps | |
| Box of Dissection Pins | Fine Science Tools | Minutien Pins 0.1mm diameter |
References
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Hurd, D. D., Saxton, W. M. Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila. Genetics. 144, 1075-1085 (1996).
- Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila. Neuron. 40, 25-40 (2003).
