Summary
可以复制自身免疫性垂体炎在小鼠体内,小鼠垂体蛋白提取物注射。
Abstract
自身免疫性垂体炎是一种慢性炎症引起或伴随着自身免疫 1的脑下垂体。它历来被认为是一种罕见的疾病,但报告已在近年来显着增加。垂体炎,事实上,发展不寻常在块上,如CTLA - 4和PD - 1受体的T淋巴细胞,表达抑制性受体与抗体治疗癌症患者的一个“副作用“。实验小鼠注射佐剂3混合垂体蛋白质可诱发自身免疫性垂体炎。在这个视频文章中,我们演示了如何从鼠标脑垂体和如何准备他们在适合SJL小鼠诱导的自身免疫性垂体炎的形式提取的蛋白质。
Protocol
实验协议
在这个试验性的协议的第一步是收集了大量鼠标脑垂体。第二个步骤是,同质化的腺体准备蛋白提取物。第三步是油性混合物乳化这些蛋白质。
第1步:鼠标脑垂体收集和储存
鼠标脑下垂体位于颅底三叉神经和视交叉前方横向包围,在所谓蝶鞍蝶骨的抑郁症。腺体组成一个较大的前叶和较小的后部和中间叶,体重平均为1.9毫克。注定要被实施安乐死的动物护理设施的混合菌株,性别,和年龄,老鼠的脑垂体收集。
要隔离脑垂体,鼠标是安乐死,上述解剖颅骨的皮肤,并用剪刀剪开颅骨骨开放。解除大脑,脑垂体,然后从周围硬脑膜分离暴露,捞起来蝶骨上干冰的塑料管中。
一般来说,我们使用一个蛋白质的准备,可以由一人在9个小时收集的300鼠标脑垂体。
一旦收集完成,包含脑垂体管保存于-80 ° C,直到准备下一个步骤。
第2步。小鼠垂体蛋白的提取
- 同质化的缓冲区,以添加15毫升猎鹰管(目录没有352059)保持在冰浴,每收集100脑垂体使用250的缓冲液。使用的是细胞质内的细胞生理pH(7.4)(0.2 M)和生理上的一个类似的离子强度缓冲。我们用磷酸盐缓冲液(0.161 M,pH值7.4),辅以一种蛋白酶抑制剂的鸡尾酒(Sigma - Aldrich公司,目录没有P8340 - 1ML)。
- 添加脑垂体刚刚在同质化的缓冲区,然后将宝创匀浆发电机猎鹰管的底部(直径5毫米)。均质最高转速为30秒,轻轻移动猎鹰管向上和向下,同时保持在冰浴。然后休息1分钟冰匀浆。重复的同质化和冷却步骤两次。要打破这种温柔的同质化细胞,而不破坏的原子核并释放胞浆蛋白。
- 要去除细胞核,完整的组织和不溶物(如结缔组织,变性的蛋白复合物),离心机在低转速(千克)的匀浆液在4 ° C 10分钟
- 转移上清(现在叫后核上清,PNS)到一个新的猎鹰管,照顾离开颗粒不受干扰,并存储在冰上的PNS的。
- 在同质化的缓冲区的原始卷(250μL每收集100脑垂体的缓冲区)重悬沉淀,上述均质,离心上述,然后结合第二PNS的第一个。
- 分装在两个汇集PNS的样品到离心管中并储存在-80 ° C直到为下一步做好准备。这种蛋白制备可存放于-80 ° C,但逐渐失去其效力,因此,我们建议在6个月从筹备内使用。使用一个小等分,以确定蛋白质产量和浓度由BCA检测(皮尔斯目录。23225),并通过凝胶电泳的蛋白质质量。在一般情况下,我们从300鼠标垂体获得约60毫克的蛋白质,同质化的缓冲液在1.5毫升,在浓度40毫克/毫升左右。
第3步。免疫乳液的制备
- 迅速解冻实验所需的冷冻蛋白等分,调整蛋白浓度为20毫克/毫升。将这种蛋白质提取物乳化1:1与完全弗氏佐剂(终审法院,Sigma公司的F - 5881)含有5毫克/毫升杀害结核分枝杆菌(Becton Dickinson公司,231141)的热量。每个鼠标将获得1毫克的垂体提取物在100μL乳液。
- 这里给出的例子是免疫10只小鼠,其中每个鼠标将注入100μL含有1毫克垂体蛋白质的乳液。允许两个额外的小鼠物质损失,所以在准备使用12毫克垂体蛋白质。上面描述的使用2.5毫升汉密尔顿气密性注射器的Aspire 600μL的20毫克/毫升垂体蛋白提取物。重悬通过晃动终审法院,并渴望进入另一个2.5 mL的汉密尔顿注射器的600μL的终审法院。连接和安全的一个22号的微乳化针头与终审法院填补了注射器。慢慢推针是与终审法院填补的终审法院注射器的柱塞,然后连接和安全的另一端充满垂体提取物的注射器针头。
- 慢慢推进终审法院的注射器的柱塞推入acqueous脑垂体提取物,这样,只有少量混合油成分。然后向后推到终审法院的注射器柱塞的脑垂体中提取注射器。逐步增加混合材料的数量,重复此动作。继续混合,直到两个注射器的全部内容。您将获得代表的油包水型乳化发白和均匀分布的解决方案。
- 一旦形成乳液,至少有500次重复的往复运动,以确保完全混合乳液。最终混合周期后,1:1的油包水型乳化液就可以使用,包含垂体蛋白浓度为10毫克/毫升。乳化将在同一天注射,皮下麻醉SJL小鼠,在同伴的Jove文章详细。
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Discussion
尽管自身免疫性垂体炎的第一个病人是在1962 年第4期报道,垂体自身抗原的致病性仍有待确定5。动物模型是非常有用的,以确定这些自身抗原的,协助的生物标志物,是可翻译的病人护理的发现。本文演示了一个简单的程序,准备在垂体蛋白质的形式,在实验动物诱发自身免疫性垂体炎是足够的。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由美国国立卫生研究院授予DK080351 PC支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
15-ml Falcon tubes | |||
homogenization buffer | |||
phosphate buffered saline | |||
protease inhibitor cocktail | |||
Polytron homogenizer | |||
BCA assay | Pierce, Thermo Scientific | 23225 | |
Complete Freund’s Adjuvant (CFA) | Sigma-Aldrich | F-5881 | |
Mycobacterium tuberculosis | BD Biosciences | 231141 | |
2.5 mL Hamilton gastight syringe | |||
22-gauge micro-emulsifying needle |
References
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