Summary
हम के गठन के लिए एक सरल, तेजी से और मजबूत विधि का वर्णन
Abstract
Candida albicans समझौता रोगियों और कैंडिडिआसिस के एक विस्तार जनसंख्या में फंगल संक्रमण का सबसे लगातार कारण बनी हुई है अब अमेरिकी अस्पतालों में तीसरे सबसे आम संक्रमण है. कैंडिडिआसिस के विभिन्न अभिव्यक्तियों biofilm गठन, दोनों मेजबान के ऊतकों और / या चिकित्सा उपकरणों (यानी कैथेटर) पर के साथ जुड़े रहे हैं. Biofilm गठन नकारात्मक नैदानिक निहितार्थ किया जाता है, के रूप में biofilms कोशिकाओं के भीतर मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से और antifungals की कार्रवाई से संरक्षित कर रहे हैं. हम एक सरल, तेज और मजबूत सी. के गठन के लिए इन विट्रो में मॉडल विकसित किया है 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट, जो भी biofilm रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का उपयोग albicans biofilms . इस परख के readout वर्णमिति metabolically सक्रिय कवक biofilm कोशिकाओं द्वारा XTT कमी (एक tetrazolium नमक) पर आधारित है,. एक ठेठ प्रयोग रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के लिए एक अतिरिक्त 24 घंटे के साथ biofilm गठन के लिए लगभग 24 घंटे लगते हैं. अपनी सादगी और आमतौर पर उपलब्ध प्रयोगशाला सामग्री और उपकरणों के उपयोग की वजह से, इस तकनीक biofilm अनुसंधान democratizes और फंगल biofilms के रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के मानकीकरण की दिशा में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करता है.
Protocol
1. सी. तैयार albicans
सी. albicans के एक जोखिम समूह 1/BSL1 सूक्ष्मजीव है . हमेशा इस सूक्ष्मजीव के साथ काम करने के लिए अच्छा सड़न रोकनेवाला / बाँझ तकनीक और उपयोग biohazard सामग्री के समुचित निपटान के लिए संस्थागत प्रक्रिया का पालन करें याद है.
- सी. की एक रात संस्कृति की तैयारी सी के एक एकल कॉलोनी inoculating YPD (खमीर Peptone Dextrose) तरल माध्यम में albicans YPD के 25 एमएल में albicans.
- एक कक्षीय हिलनेवाला (लगभग 180 rpm) में 30 ° रातोंरात सी संस्कृति को सेते हैं. हाल सी. albicans खमीर कोशिकाओं के रूप में उपभेदों इन शर्तों के तहत विकसित होगा.
- अपकेंद्रित्र रातोंरात संस्कृतियों (बारे में 3,000 rpm, 5-10 मिनट), कोशिकाओं बाँझ पीबीएस के साथ दो बार, धोने और के बारे में 165 मिमी morpholinepropanesulfonic पीएच 7.0 और पूर्व गर्म करने के लिए एसिड के साथ RPMI +१६४० बफर मध्यम 20-25 एमएल में अंतिम गोली resuspend 37 में डिग्री सेल्सियस (अब से इस माध्यम पर बस "RPMI 1640" के रूप में जाना जाता है).
- एक hemacytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना. गिनती के बाद, 1.0 10 6 कोशिकाओं / एमएल में 1640 RPMI एक्स के अंतिम घनत्व पर कक्षों की एक निलंबन तैयार.
नोट: क्योंकि कोशिकाओं कुल के लिए एक प्रवृत्ति है, यह सख्ती धोने के बीच और pipetting पहले भंवर के लिए महत्वपूर्ण है.
2. Biofilm के गठन के लिए 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट की स्थापना
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग सी. के 100 μL जोड़ने 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट (एस) के चयनित कुओं में albicans के निलंबन. स्तंभ में 12 कुओं के लिए कोशिकाओं को जोड़ने के लिए, के रूप में इन नकारात्मक नियंत्रण के रूप में काम करेंगे मत करो.
- कवर अपने मूल ढक्कन के साथ पूरे microtiter प्लेट, parafilm के साथ सील, एक मशीन और 24 घंटे के लिए सेते अंदर 37 में जगह डिग्री सेल्सियस ऊष्मायन की लंबाई विशिष्ट प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, यह संभव है करने के लिए 24 की अवधि में biofilm गठन के कैनेटीक्स की जांच - कई प्लेटें बोने और अलग अलग समय अंक (2 यानी, 4, 8, 12, 24 और 48 घंटे) में एक थाली प्रसंस्करण द्वारा 48 घंटे
- Biofilm गठन के बाद, एक multichannel विंदुक का उपयोग मध्यम छूने के लिए सावधानी के रूप में और नहीं है कि कुओं की प्रत्येक में गठन किया है biofilms को बाधित aspirate.
- एक multichannel विंदुक धोने प्लेटें बाँझ पीबीएस (अच्छी तरह से 200 प्रति μL) में तीन बार का उपयोग करना. वैकल्पिक रूप से, एक स्वचालित microtiter प्लेट वॉशर का उपयोग करें. Washes के बीच, और विशेष रूप से पिछले धोने के बाद, सोख्ता कागज तौलिये के साथ किसी भी अवशिष्ट पीबीएस हटायें द्वारा एक औंधा स्थिति में प्लेटें नाली. इस बिंदु पर कुओं के तल पर गठित biofilms नग्न आंखों से भी स्पष्ट रूप से दिखाई दे सकता है और भी visualized किया जा सकता है एक उलटा माइक्रोस्कोप (चित्रा 1) का उपयोग करना चाहिए. Biofilms अब रोधी संवेदनशीलता परीक्षण assays के लिए संसाधित किया जा करने के लिए तैयार हैं.
(यदि प्रयोग का मुख्य उद्देश्य biofilm गठन की हद तक का आकलन है, प्लेटें वर्णमिति विधि का उपयोग संसाधित किया जा करने के लिए तैयार कर रहे हैं इस के लिए, अभिकर्मक / XTT menadione (3 नीचे चरण देखें) और जोड़ा जा सकता है जिसके परिणामस्वरूप रंग. एक microtiter प्लेट रीडर का उपयोग कर पढ़ें).
3. Biofilms के ऐंटिफंगल संवेदनशीलता परीक्षण
- शेयर समाधान या पाउडर से प्रत्येक के लिए परीक्षण किया जा ऐंटिफंगल के माध्यम 1640 में RPMI एक काम समाधान तैयार. ठेठ उच्च सांद्रता 1024 μg / fluconazole के लिए एमएल, और 16 μg / दोनों amphotericin बी और caspofungin के लिए एमएल हैं. अन्य सांद्रता विभिन्न एजेंटों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, 1 कॉलम में प्रत्येक फंगल biofilms वाले microtiter प्लेट की इसी कुओं को ऐंटिफंगल के उच्च कार्य एकाग्रता की 200 μL जोड़ने.
- प्रत्येक अच्छी तरह से 10 से 2 कॉलम में 1640 के 100 RPMI μL जोड़ें.
- स्तंभ में 11 कुओं RPMI 1640 के 100 μL जोड़ें.
- 1 स्तंभ के कुओं से ऐंटिफंगल एजेंट के 100 μL निकालें और स्तंभ 2 में आसन्न कुओं (पहले से ही के माध्यम 100 μL युक्त) को जोड़ने.
- Pipetting और नीचे के लिए एक धारावाहिक दोहरीकरण कमजोर पड़ने प्रदर्शन के द्वारा अच्छी तरह से सामग्री मिक्स, और सुझावों को हटायें.
- 10 स्तंभ के कुओं, जिसके बाद अंतिम मिश्रण के बाद 100 10 स्तंभ के कुओं से μL मात्रा खारिज कर दिया है जब तक सही चल दोहराएँ. इस रास्ते में, ब्याज की अपने एजेंट (एस) के दोहरीकरण dilutions की एक श्रृंखला बनाया गया है, से सबसे कम से कम 10 स्तंभ के कुओं में केंद्रित 1 स्तंभ के कुओं में केंद्रित है. 11 स्तंभ में चुनौती biofilms सकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा है, और 12 स्तंभ में खाली कुओं नकारात्मक नियंत्रण के रूप में सेवा करेंगे.
- अपने lids, parafilm और सेते साथ 24 -48 घंटे के लिए सील के साथ 37 प्लेटों को कवर डिग्री सेल्सियस
- ऊष्मायन अवधि के बाद (3 एक्स पीबीएस) के पहले 2.4 चरण के रूप में प्लेटें धोने.
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग अच्छी तरह से एक biofilm पूर्व धोया युक्त प्रत्येक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पृष्ठभूमि एक्स की माप के लिए नकारात्मक नियंत्रण कुओं XTT / menadione समाधान के 100 μL जोड़नेटीटी - वर्णमिति स्तर.
- XTT 0.5 छ / बाँझ घंटी लैक्टेट, Pbs या खारा है, जो 0.22 आकार सुक्ष्ममापी ताकना फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर निष्फल होने की जरूरत है में एल में एक संतृप्त समाधान के रूप में तैयार है. XTT संवेदनशील प्रकाश समाधान है, तो यह तैयारी के दौरान एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किया जाना चाहिए. एक बार तैयार है और फिल्टर निष्फल 10 एमएल काम कर रहे मात्रा में विभाज्य, और दुकान -70 डिग्री सेल्सियस एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग कर प्रकाश से ट्यूबों को सुरक्षित रखें. कई ट्यूबों के रूप में केवल के रूप में एक विशेष रूप से ठीक पहले प्रयोग करने के लिए उपयोग के लिए जरूरत पहले गला लें.
- Menadione 100% एसीटोन में एक 10 मिमी शेयर समाधान, छोटे संस्करणों (के बारे में 50 μL) में aliquoted और -70 पर संग्रहीत डिग्री सेल्सियस के रूप में तैयार है समाधान / XTT menadione बस से पहले की तैयारी का उपयोग करने के लिए एक thawed XTT समाधान के 10 एमएल युक्त ट्यूब menadione का जायजा समाधान के एक μL जोड़कर.
- 37 पर कवर और 2 घंटे के लिए अंधेरे में एल्यूमीनियम पन्नी सेते में प्लेटें डिग्री सेल्सियस
- प्लेटों को उजागर. एक multichannel विंदुक का प्रयोग प्रत्येक अच्छी तरह से और हस्तांतरण से एक नए microtiter प्लेट की इसी कुओं में रंगीन सतह पर तैरनेवाला के परिणामस्वरूप 80 μL हटायें.
- 490 एनएम पर एक microtiter प्लेट रीडर में प्लेट (-s) पढ़ें.
- बिना डंठल न्यूनतम निरोधात्मक SMIC50 और SMIC80 सांद्रता, जो ऐंटिफंगल सांद्रता वर्णमिति रीडिंग में एक 50% या 80% की कमी, जिस पर नियंत्रण रोधी दवा के अभाव में गठन biofilms (इस मामले में 11 स्तंभ के लिए मानों की तुलना में पता चला रहे हैं कर रहे हैं की गणना यह भी याद रखना XTT केवल युक्त स्तंभ में 12 कुओं से नकारात्मक नियंत्रण से मान) घटाना. SMIC परिणाम (यानी कई antifungals के खिलाफ कई आइसोलेट्स) तालिका या वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक व्यक्ति के प्रत्येक ऐंटिफंगल के खिलाफ अलग कवक के लिए परिणामों ऐंटिफंगल एकाग्रता बनाम प्रतिशत निषेध की साजिश रचने के द्वारा एक ग्राफ के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है के रूप में प्रस्तुत किया जा सकता है.
उदाहरण: नकारात्मक नियंत्रण में मानों को घटाकर बाद, नियंत्रण biofilms के औसत आयुध डिपो 11 स्तंभ में गठित 1.32 है . SMIC50 न्यूनतम ऐंटिफंगल> वर्णमिति रीडिंग में 50% की कमी करने के लिए अग्रणी एकाग्रता इस मामले में कम से कम 1.32 50/100 x = 0.66 में है. इसी तरह, SMIC80 न्यूनतम ऐंटिफंगल> वर्णमिति रीडिंग में 80% की कमी करने के लिए अग्रणी एकाग्रता इस मामले में कम से कम 1.32 20/100 x = 0.264,.
4. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 से पता चलता है एक सी. के एक microphotograph albicans biofilm एक 96 अच्छी तरह से microtiter एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए लिया थाली में एक अच्छी तरह से नीचे पर का गठन किया था. चित्रा 2 से पता चलता है एक सी. के 11 biofilms के प्रत्येक के लिए XTT वर्णमिति रीडिंग (आयुध डिपो 490 मान ) वही 96 अच्छी तरह से microtiter थाली के 8 अलग अलग पंक्तियों में से प्रत्येक में गठित albicans के जंगली प्रकार तनाव . चित्रा 3 सी. के खिलाफ विभिन्न सांद्रता में amphotericin बी की गतिविधि से पता चलता है albicans biofilms, तीर SMIC50 और SMIC80 मूल्यों से संकेत मिलता है.
चित्रा 1 (ए) एक पैनल लिया microphotograph एक सी. के एक उलटा माइक्रोस्कोप से जुड़ी कैमरे का उपयोग कर दिखाता है albicans biofilm RPMI मध्यम और पीबीएस के साथ बाद धोने की आकांक्षा के बाद अच्छी तरह से नीचे पर का गठन किया . (बी) एक ठेठ सी. के एक माइक्रोग्राफ albicans biofilm इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग कल्पना . बार्स पैनल के लिए ए और बी क्रमशः 100 और सुक्ष्ममापी 10 सुक्ष्ममापी हैं.
चित्रा 2. एकाधिक बराबर सी. के गठन 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में albicans biofilms biofilms के XTT में कमी assays से वर्णमिति रीडिंग (आयुध डिपो 490 मान) द्वारा गठित एक सी.. albicans microtiter प्लेटों के कुओं में जंगली प्रकार. मान वही 96 अच्छी तरह से microtiter थाली के 8 अलग अलग पंक्तियों में से प्रत्येक में 11 स्वतंत्र गठन biofilms के लिए कर रहे हैं. परिणाम के अलग - अलग पंक्तियों के लिए विचरण के विश्लेषण एक रास्ता है और प्रसरण की एकरूपता और Bonferroni एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद के लिए बार्टलेट परीक्षण का उपयोग कर के द्वारा की तुलना में थे. कोई सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद जब एक दूसरे को (पी> 0.05) के लिए पंक्तियों की सभी जोड़ों की तुलना में नोट कर रहे थे.
चित्रा 3. सी. खिलाफ रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के ठेठ परिणाम albicans biofilms एक सी. के biofilms के खिलाफ अलग amphotericin बी सांद्रता की प्रभावकारिता की विशिष्ट परिणाम चित्रण. ग्राफ़ albicans के जंगली प्रकार तनाव. मान XTT कमी कुओं नियंत्रण की तुलना में assays के लिए औसत प्रतिशत वर्णमिति रीडिंग के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. SMIC50 और SMIC80 मूल्यों तीर द्वारा संकेत कर रहे हैं.
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Discussion
यहाँ हम एक सरल, तेजी से, किफायती और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य Candida के एक वर्णमिति विधि है कि XTT का उपयोग biofilm के भीतर कोशिकाओं के चयापचय गतिविधियों के उपाय के साथ मिलकर biofilms के गठन के लिए 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट मॉडल का वर्णन करता है. यह 96 biofilm गठन के लिए अच्छी तरह से microtiter प्लेट मॉडल मूल रूप से सी के लिए विकसित किया गया था albicans लेकिन अन्य Candida एसपीपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है . और अन्य कवक जीवों के लिए आसानी से रूपांतरित किया. विधि करने के लिए एकाधिक मापदंडों और biofilm गठन को प्रभावित करने वाले कारकों की जांच करने और biofilm गठन एकाधिक कवक आइसोलेट्स और / या उत्परिवर्ती उपभेदों की क्षमता का अनुमान किया जा सकता है. लेकिन शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, इस विधि biofilms के भीतर कोशिकाओं की रोधी संवेदनशीलता परीक्षण के निर्धारण के लिए बहुत उपयोगी है.
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Disclosures
JLL आर MicrobeHTS टेक्नोलॉजीज, Inc, जो ऐंटिफंगल एजेंटों विकसित कर रहा है में इक्विटी का मालिक है. MicrobeHTS टेक्नोलॉजीज इंक, इन अध्ययनों के लिए कोई वित्तीय सहायता प्रदान की है.
Acknowledgments
प्रयोगशाला में biofilm से संबंधित काम अनुदान द्वारा वित्त पोषित है दंत चिकित्सा और craniofacial रिसर्च और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोगों JLL (आर) के लिए राष्ट्रीय संस्थान से R21DE017294 और R21AI080930 गिने. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता NIDCR, NIAID या एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
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