Summary
우리는 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한 방법을 설명
Abstract
캔디다 albicans 지금은 미국 병원에서 세 번째로 가장 일반적인 감염 위험 환자와 칸디다 증의 확대 인구의 곰팡이 감염의 가장 빈번한 원인 남아있다. 칸디다 증의 발현은 다른 호스트 조직 및 / 또는 의료 기기 (즉 카테터)에 두 biofilm 형성과 관련이 있습니다. biofilms 내에서 세포가 면역 반응 호스트로부터 antifungals의 행동으로부터 보호되면서 Biofilm 형성은 부정적인 임상 영향을 수행합니다. 우리는 C. 형성을위한 간단하고 신속하고 강력한에서 체외 모델을 개발 또한 biofilm antifungal 자화율 시험에 사용할 수있는 96 잘 microtiter - 접시를 사용 albicans의 biofilms. 이 분석의 판독은 metabolically 활성 곰팡이 biofilm 세포에 의해 XTT의 감소 (tetrazolium 소금)을 기반으로, colorimetric입니다. 전형적인 실험은 antifungal 자화율 시험에 대한 추가 24 H와 biofilm 형성에 대한 약 24 H 걸립니다. 때문에 단순하고 일반적으로 사용 가능한 실험실 재료 및 장비의 사용이 기술은 biofilm 조사를 democratizes 및 곰팡이 biofilms의 antifungal 자화율 테스트 표준화 향한 중요한 단계를 나타냅니다.
Protocol
1. C.의 준비 albicans
C. albicans는 위험 그룹 1/BSL1 미생물입니다. 항상이 미생물과 함께 일을 잘 무균 / 살균 기술을 사용하여 생물 학적 물질의 적절한 처리를위한 제도적 절차를 따르도록 기억 해요.
- C.의 야간 문화를 준비 C.의 단일 식민지 inoculating하여 YPD (효모 펩톤 덱스 트로 오스) 액체 매체 albicans YPD 25 ML에 albicans.
- 30 ° C 하룻밤에 궤도 쉐이크 (180 RPM)에서 문화를 품다. 대부분의 C. albicans 변종이 조건 하에서 효모 세포로 성장합니다.
- 야간 문화를 (약 3,000 RPM, 5-10분) 원심 분리기, 멸균 PBS로 두 번 세포를 씻어하고, 산도 7.0과 미리 예열을 165 MM morpholinepropanesulfonic의 산성과 버퍼 RPMI 1640 매체의 20-25에 대해 ML의 마지막 펠릿을 resuspend 37 ° C가 (이 매체에 지금부터 간단하게 "RPMI 1640"이라고합니다).
- hemacytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 계산 후, 1.0 X 10 6 세포 / RPMI 1640에 ML의 최종 농도에서 세포 현탁액을 준비합니다.
참고 : 세포가 집계하는 경향을 가지고 있기 때문에,이 세탁 사이 pipetting 전에 적극적으로 와동하는 것이 중요합니다.
2. Biofilm의 형성을위한 96 - 웰 플레이트 Microtiter 설정
- 멀티채널 피펫을 사용하면 C. 100 μL를 추가 96 - 웰 플레이트 microtiter (- S)의 선택 우물에 albicans 서스펜션. 이들은 부정적인 조절 역할을하므로, 열 12 우물에 전지를 추가하지 마십시오.
- 원래 뚜껑이있는 전체 microtiter 접시, parafilm와 인감, 37 24 H에 대한 보육 및 품어 안으로 장소 ° C. 표지 부화의 길이는 특정 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 다른 시간 지점 (즉 2, 4, 8, 12, 24 및 48 H)에서 여러 개의 접시를 시딩 각 플레이트를 처리하여 48 시간은 됐어 - 예를 들어, 24의 기간 동안 biofilm 형성의 속도론을 조사 할 수 있습니다
- biofilm 형성 후, 멀티채널 피펫을 사용하는 것은 신중로 우물 각 형성 biofilms를 만지거나 방해하지 매체를 대기음.
- 멸균 PBS (물론 당 200 μL)에서 멀티채널 피펫 세척 접시 세 번 사용합니다. 또는 자동 microtiter 접시 세척기를 사용합니다. 세척 사이에, 특히 마지막 세척 후, 잔여 PBS를 제거하기 위해 종이 타월과 모래 바닥으로 바뀌 위치에 접시를 물기. 이 시점에서 우물의 바닥에 형성 biofilms도 육안으로 분명히 볼 수 있어야하며 거꾸로 현미경 (그림 1)를 사용하여 시각하실 수 있습니다. Biofilms 지금 antifungal 자화율 시험 assays을 위해 처리될 준비가 된 것입니다.
(실험의 주요 목적은 biofilm 형성의 범위를 평가하는 경우에는 번호판 colorimetric 방법을 사용하여 처리할 준비가 된 것입니다.이 경우, XTT / 메나 디온 시약은 (아래 3 단계 참조) 결과 색상을 추가하고 수 ) microtiter 플레이트 판독기를 사용하여 읽어보십시오.
3. Biofilms의 Antifungal 자화율 테스트
- 재고 솔루션 또는 분말에서, 테스트되는 각 antifungal의 RPMI 1640 배지에서 작업 솔루션을 준비합니다. 전형적인 높은 농도는 1,024 fluconazole에 대한 μg / ML, 16 amphotericin B와 caspofungin 모두 μg / ML 있습니다. 다른 농도가 다른 에이전트에 사용할 수 있습니다.
- 멀티채널 피펫을 사용하여 곰팡이 biofilms를 포함하는 각 microtiter 접시 컬럼의 1에 해당 우물에 antifungal의 높은 작업 농도 200 μL를 추가합니다.
- 10 열 2 각 잘하는 RPMI 1640 100 μL를 추가합니다.
- 열 11 우물에 RPMI 1,640 100 μL를 추가합니다.
- 열 1의 우물에서 antifungal 요원 100 μL를 제거 및 열 2의 인접 우물 (이미 매체의 100 μL를 포함)에 추가할 수 있습니다.
- 잘 직렬 두 배로 희석을 수행하고 위아래로 pipetting하여 내용을 혼합하고, 도움말을 제거합니다.
- 오른쪽 혼합 후 열 10 우물에서 최종 100 μL 볼륨이 삭제되는 열의 후 10 우물, 이동 때까지 반복합니다. 이러한 방법으로 관심의 에이전트 (- S)의 dilutions을 배로 일련의이 생성되었습니다; 대부분 열 10 우물에 최소 농축 열 1의 우물에 집중되어에서. 열 11 도전받지 않은 biofilms 긍정적인 컨트롤로 제공되며, 열에 12 빈 우물은 부정적인 제어 역할을합니다.
- 37 그들의 뚜껑, 24 -48 H에 대한 parafilm과 부화로 도장과 번호판을 커버 ° C.
- 잠복기 후 (3 X PBS) 이전 단계 2.4로 접시를 씻으십시오.
- 멀티채널 피펫을 사용하면 배경 X의 측정에 대한 부정적인 제어 우물에 잘 미리 씻어 biofilm을 포함하는 각각의뿐만 아니라 XTT / 메나 디온 솔루션 100 μL를 추가TT - colorimetric 수준.
- XTT는 0.5 0.22 μm의 - 기공 크기의 필터를 사용하여 필터 소독해야 멸균 링거스 락테이트, PBS 또는 호수에 G / L에서 포화 솔루션으로 준비가되어 있습니다. XTT 솔루션은 민감한 빛 때문에, 그것은 준비 중에 알루미늄 호일으로 덮여 있어야합니다. -70 번에 준비 및 필터 - 소독, 10 ML 작업 볼륨으로 나누어지는하고, 저장 ° C. 알루미늄 호일을 사용하여 빛을에서 튜브를 보호합니다. 사용하기 직전 특정 실험에 필요한 많은 튜브로만 해동.
- 메나 디온은 작은 볼륨 (약 50 μL)로 aliquoted과 -70에 저장된 100 % 아세톤에 10 MM 주식 솔루션 ° C.으로 준비가되어 있습니다 해동 XTT 솔루션 10 ML을 포함하는 튜브에 메나 디온의 주식 솔루션 1 μL를 추가하여, 사용하기 직전 XTT / 메나 디온 솔루션을 준비합니다.
- 37 2 H 동안 짙은 어둠 속에서 알루미늄 호일과 부화에 번호판을 커버 ° C.
- 번호판을 발견. 멀티채널 피펫을 사용하면 새로운 microtiter 접시의 해당 우물에 각각 잘하고 전송에서 발생하는 색깔 뜨는의 80 μL를 제거합니다.
- 490 NM에서 microtiter 플레이트 판독기에서 접시를 (- S) 참조하십시오.
- colorimetric 판독의 50 % 80퍼센트 감소가 antifungal 약물의 부재에 형성된 제어 biofilms에 비해 (이 경우 항목에 11 값을 감지되는 antifungal 농도의 고착의 최소 억제 농도 SMIC50과 SMIC80를 계산 ,) 만 XTT를 포함하는 열에 12 우물에서 부정적인 컨트롤에서 값을 빼야하는 것도 기억나요. SMIC 결과는 표 (여러 antifungals에 대해 즉, 여러 개의 격리) 혹은 다른 방법으로, 각 antifungal에 대한 격리 각 곰팡이에 대한 검색 결과가 antifungal 농도 비교 %의 억제를 계획하여 그래프로 제시 수 있듯이 제시하실 수 있습니다.
예 : 대조군의 값을 공제한 후, 열 11 형성된 제어 biofilms의 평균 OD가 1.32입니다. SMIC50이 경우보다 1.32 X 100분의 50가 = 0.66에서 colorimetric 낭독의> 50 % 감소로 이어지는 가장 낮은 농도 antifungal입니다. 마찬가지로, SMIC80이 경우보다 1.32 X 1백분의 20가 = 0.264에서 colorimetric 낭독의> 80 % 감소로 이어지는 가장 낮은 농도 antifungal입니다.
4. 대표 결과
그림 1은 C.의 microphotograph을 보여줍니다 albicans biofilm은 거꾸로 현미경을 사용하여 촬영 96 잘 microtiter 접시에있는 우물의 바닥에 형성. 그림 2는 C. 11 biofilms 각 XTT - colorimetric 신호 (OD 490 값을)를 보여줍니다 albicans 야생 유형 스트레인 같은 96 잘 microtiter 접시의 8 가지 행을 각 형성. 그림 3은 C.에 대해 서로 다른 농도에서 amphotericin B의 활동을 보여줍니다 albicans biofilms; 화살표 SMIC50과 SMIC80 값을 나타냅니다.
그림 1. (A) 패널은 C.의 거꾸로 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 촬영한 microphotograph을 보여줍니다 albicans biofilm은 RPMI 매체와 PBS와 후속 세탁의 열망 후 우물의 바닥에 형성. 전형적인 C의 (B) 현미경 albicans biofilm은 스캐닝 전자 현미경을 사용하여 시각. 바 패널 각각 A와 B 100 μm의 10 μm의 수 있습니다.
그림 2. 여러 동등한 C.의 형성 96 - 웰 microtiter 접시에 albicans biofilms. C. 형성 biofilms의 XTT - 감소 assays에서 Colorimetric 판독 (OD 490 값이) microtiter 접시의 우물에서 albicans 야생 입력합니다. 값은 동일한 96 잘 microtiter 접시 8 다른 행의 각 형성 11 독립 biofilms위한 것입니다. 다른 행에 대한 결과는 편도 분산 분석 및 변동의 균질성 및 Bonferroni의 다중 비교 후 시험에 바틀 테스트를 사용하여 비교했다. (P> 0.05) 서로의 모든 행을 쌍을 비교하면 아무 통계적으로 의미있는 차이는 언급되지 않았다.
그림 3. C. 반대 antifungal 자화율 시험의 일반적인 결과 C.의 biofilms에 대한 다른 amphotericin B로 농도의 효능의 전형 결과를 묘사한 albicans biofilms. 그래프 albicans 야생 유형 변형. 값은 우물을 제어에 비해 XTT - 감속 assays 평균 퍼센트 colorimetric 수치로 표현됩니다. SMIC50과 SMIC80 값은 화살표로 표시됩니다.
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Discussion
여기 XTT를 사용하여 biofilm 내에서 세포의 대사 활동을 측정 colorimetric 방법으로 결합 캔디다 biofilms의 형성을위한 단순하고 신속하고 경제적이며 높은 재현성 96 웰 플레이트 microtiter 모델을 설명합니다. biofilm 형성을위한이 96 잘 microtiter 플레이트 모델은 원래 C. 위해 개발되었습니다 albicans하지만 다른 캔디다 종에 사용될 수 있습니다. 쉽게 다른 곰팡이 유기체에 대한 적응. 방법은 여러 매개 변수 및 biofilm 형성에 영향을 미치는 요인을 조사하고 여러 곰팡이 격리 및 / 또는 돌연변이 종자의 biofilm - 형성 능력을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 하지만 아마도 가장 중요한 것은,이 방법은 biofilms 내에서 세포의 antifungal 자화율 테스트 결정에 매우 유용합니다.
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Disclosures
JLL - R은 antifungal 요원을 개발 MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사에 지분을 소유하고 있습니다. MicrobeHTS 테크놀로지 주식 회사는 이러한 연구에 대한 재정 지원을 제공하지 않습니다.
Acknowledgments
실험실에서 Biofilm 관련 작업은 부여에 의해 자금 치과 & Craniofacial 연구 및 알레르기 및 전염병 (JLL - R 있습니다.)에 대한 국립 연구소의 국립 연구소에서 R21DE017294 및 R21AI080930 번호가 있습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 NIDCR, NIAID 또는 NIH의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
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