Summary
我々はの形成のための、シンプルで迅速かつ堅牢な方法を説明します
Abstract
カンジダアルビカンスは、標的の患者とカンジダ症の拡大人口の真菌感染症の最も多い原因は、現在米国の病院で3番目に一般的な感染症である残ります。カンジダ症の異なる症状が両方のホストの組織および/または医療機器（すなわちカテーテル）で、バイオフィルム形成に関連付けられています。バイオフィルム内の細胞が宿主の免疫応答からと抗真菌薬の作用から保護されているバイオフィルム形成は、負の臨床的意義を運びます。我々は、Cの形成のための、シンプルで高速かつ堅牢なのin vitroモデルを開発したまた、バイオフィルム抗真菌薬感受性試験に使用できる96ウェルマイクロタイタープレートを、使用してカンジダバイオフィルム。このアッセイの読み出しは、代謝的に活性な菌のバイオフィルム細胞によるXTTの還元（テトラゾリウム塩）に基づいて、比色です。典型的な実験は、抗真菌薬感受性試験のための追加の24時間で、バイオフィルム形成のための約24時間かかります。そのシンプルさと一般に入手可能な実験材料および機器の使用から、この手法は、バイオフィルムの研究をdemocratizesと真菌バイオフィルムの抗真菌薬感受性試験の標準化に向けた重要な一歩を表しています。
Protocol
1。 C.の準備アルビカンス
C. albicansはリスクグループ1/BSL1微生物である。常にこの微生物との仕事のために良好な無菌/滅菌技術を使用し、有害物質の適切な処分のための制度的な手順に従うことを覚えている。
- C.の一晩培養を準備YPD（酵母ペプトンデキストロース）Cの単一コロニーを接種することにより液体培地でアルビカンス YPD 25mLのにアルビカンス 。
- 30℃で一晩オービタルシェーカー（約180回転）で培養液を、。ほとんどのC.カンジダ菌は、これらの条件下で酵母細胞として成長します。
- 一晩培養する（約3,000 rpmで、5〜10分）遠心し、滅菌PBSで細胞を2回洗浄し、pHを7.0と予め温めておいた〜165 mMのmorpholinepropanesulfonic酸で緩衝RPMI 1640培地の約20〜25 mLで、最終的なペレットを再懸濁します。 37℃は（この培地上で、今から単に"RPMI 1640"と呼ばれます）。
- 血球計を用いて細胞を数える。カウントの後、RPMI 1640で1.0 × 10 6細胞/ mlの最終濃度で細胞の懸濁液を準備。
注：細胞が凝集する傾向があるので、それは洗浄液の間に、ピペッティングの前に激しくボルテックスすることが重要です。
2。バイオフィルムの形成のために96ウェルマイクロタイタープレートのセットアップ
- マルチチャンネルピ ペットを使用すると、Cの100μLを加える96ウェルマイクロタイタープレート（- s）の選択したウェルにアルビカンスサスペンション 。これらは、ネガティブコントロールとして機能するように、カラム12のウェルに細胞を追加しないでください。
- 元のふたが付いている全体のマイクロタイタープレート、パラフィルムでシール、37℃で24時間インキュベーターでインキュベート内部の場所℃をカバーインキュベーションの長さは、特定の実験計画に適合させることができます。例えば、それは24の期間にわたってバイオフィルム形成の動態を調べることができます - 複数のプレートを播種し、異なる時点で、各プレートを処理することによって、48時間（すなわち、2、4、8、12、24および48時間）
- バイオフィルム形成後に、マルチチャンネルピペットを使用すると、慎重に各ウェルに形成されたバイオフィルムに触れると混乱しないように培地を吸引除去する。
- 滅菌PBS（ウエル当たり200μL）でマルチチャンネルピペットの洗浄プレートを3回使用する。また、自動化されたマイクロタイタープレートウォッシャーを使用してください。洗浄の間、特に最後の洗浄後、任意の残留PBSを除去するためにペーパータオルでブロッティングで逆さの位置にプレートを排出。この時点でウェルの底に形成されたバイオフィルムは、さらに肉眼ではっきり見えるはずですし、また、倒立顕微鏡（図1）を用いて可視化することができます。バイオフィルムは、現在抗真菌薬感受性試験のアッセイのために処理される準備が整いました。
（実験の主な目的はバイオフィルム形成の程度を評価する場合、プレートは比色法を用いて処理される準備が整いました。このためには、XTT /メナジオン試薬は（以下のステップ3を参照）、結果色を追加したりすることができます）マイクロタイタープレートリーダーを用いて読み取る。
3。バイオフィルムの抗真菌感受性試験
- ストック溶液や粉末から、テストする各抗真菌のRPMI 1640培地で希釈標準溶液を準備する。典型的な高濃度では、フルコナゾールは1,024μg/ mLとし、アムホテリシンBとカスポファンギン両方のための16μg/ mLとなります。他の濃度が異なるエージェントのために使用することができます。
- マルチチャンネルピペットを使用して、真菌バイオフィルムを含む各マイクロタイタープレートの1列目の対応するウェルに抗真菌の高い作業濃度200μLを加える。
- 10〜2列目に各ウェルにRPMI 1640 100μLを加える。
- 11列のウェルにRPMI 1640 100μLを加える。
- 列1のウエルからの抗真菌剤100μLを削除し、列2に隣接する井戸（既に培地100μLを含む）に追加します。
- シリアル倍希釈を行うためにピペッティングでよく内容を混ぜる、とヒントを削除する。
- 混合後の塔10の井戸からの最後の100μLボリュームが破棄された後、列10の井戸、まで右に移動繰り返します。この方法では、興味のあるエージェントの倍希釈系列（- S）が作成されていますが、ほとんどの列10の井戸の集中以上に列1の井戸に集中してから。列11の比類のないバイオフィルムは、ポジティブコントロールとして機能します、とカラム12内の空井戸は、ネガティブコントロールとして機能します。
- 37彼らの蓋、24 -48時間パラフィルムとインキュベートとシールでプレートをカバー℃に
- 潜伏期間の後に前のステップ2.4（3 × PBS）のようにプレートを洗浄する。
- マルチチャンネルピペットを使用すると、うまく背景Xの測定のための事前洗浄されたバイオフィルムだけでなく、ネガティブコントロールのウェルにを含む各XTT /メナジオン溶液100μLを加えるTT -比色レベル。
- XTTは、0.22μmの孔サイズのフィルターを用いて濾過滅菌する必要がある滅菌乳酸リンゲル液、PBSまたは生理食塩水、では0.5g / Lでの飽和溶液として調製される。 XTT溶液は光に敏感ですので、準備中にアルミホイルで覆われるべきである。 -70一度作成すると、フィルター滅菌、10 mLの作業量に分注し、および店舗℃にアルミ箔を使用して光からチューブを保護します。使用直前に特定の実験の必要に応じて、多くの管としてだけ解凍。
- メナジオンは、100％アセトン、少量（約50μL）に分注し、-70℃で保存中の10mMストック溶液として調製され融解XTT溶液10mlを含むチューブにメナジオンのストック溶液の1μLを添加することにより、使用直前にXTT /メナジオン溶液を調製します。
- 37℃2時間暗所でアルミホイルとインキュベートでプレートをカバー℃に
- プレートを発見。マルチチャンネルピペットを使用すると、新しいマイクロタイタープレートの対応するウェルに、結果色の各ウェルからの上清と伝達の80μLを削除します。
- 490nmでマイクロタイタープレートリーダーでプレート（- s）をお読みください。
- 比色測定値の50％または80％減少は抗真菌薬の非存在下で形成された制御バイオフィルムと比較して（この場合は11列の値で検出されるときの抗真菌濃度である固着性の最小発育阻止濃度SMIC50とSMIC80を、計算する、）のみXTTを含むカラム12の井戸からネガティブコントロールから値を減算することも忘れないでください。 SMIC結果を表として提示することができます（複数の抗真菌剤に対するすなわち、複数の分離株）またはその代わり、各抗真菌に対して分離、個々の真菌の結果は、阻害率に対する抗真菌濃度をプロットしてグラフとして表示することができます。
例：ネガティブコントロールの値を減算した後、カラム11に形成された制御のバイオフィルムの平均ODは1.32です。 SMIC50は1.32 X 100分の50 = 0.66よりも小さいこのケースでは、比色測定値の> 50％の削減につながる最も低い抗真菌濃度である。同様に、SMIC80は1.32 X 100分の20 = 0.264よりも小さいこのケースで比色測定値の> 80％削減、につながる最も低い抗真菌濃度である。
4。代表的な結果
図1は、Cの顕微鏡写真を示しています。 albicansのバイオフィルムは、倒立顕微鏡を使用して撮影した96ウェルマイクロタイタープレートのウェルの底面上に形成。図2は、Cの 11バイオフィルムのそれぞれについてXTT -比色測定値（OD 490の値）を示しています。 albicansの野生型株は、同じ96ウェルマイクロタイタープレートの8つの異なる行のそれぞれに形成。図3は、C.に対して、異なる濃度のアムホテリシンBの活性を示しています。 albicansのバイオフィルム、矢印はSMIC50とSMIC80値を示している。
図1（）パネルC.の倒立顕微鏡に取り付けられたカメラで撮影した顕微鏡写真を示しています。 albicansのバイオフィルムは、RPMI培地、PBSで、その後の洗浄液の吸引後にウェルの底部に形成された。典型的なCの（B）顕微鏡写真albicansのバイオフィルムは、走査型電子顕微鏡を用いて視覚化。バーは、AとBそれぞれのパネルでは100μmと10μmのです。
図2。複数の等価なCの形成96ウェルマイクロタイタープレート中のカンジダバイオフィルム。C.によって形成されたバイオフィルムのXTT還元アッセイから比色測定値（OD 490の値）マイクロタイタープレートのウェルにalbicansは野生型。値が同じ96ウェルマイクロタイタープレートの8つの異なる行のそれぞれに形成された11の独立したバイオフィルムのためのものです。別の行の結果は、一方向の分散分析と分散の均一性とボンフェローニの多重比較、ポストテストのためのバートレットの検定を用いて比較した。 （P> 0.05）お互いに行のすべてのペアを比較する際には統計的に有意な差は認められなかった。
図3。 C.に対して抗真菌薬感受性試験の典型的な結果 C.のバイオフィルムに対して異なるアムホテリシンBの濃度の効果の典型的な結果を描いたalbicansのバイオフィルム。グラフalbicansの野生型株。値は、井戸を制御するために比較してXTT還元アッセイの平均パーセント比色測定値として表現されています。 SMIC50とSMIC80値は矢印で示されている。
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Discussion
ここでは、XTTを使ってバイオフィルム内の細胞の代謝活性を測定する比色法と相まって、カンジダバイオフィルムの形成のための、シンプル、迅速、経済的かつ再現性の高い96ウェルマイクロタイタープレートのモデルを説明します。バイオフィルム形成のためのこの96ウェルマイクロタイタープレートのモデルは、もともとC用に開発されたアルビカンスが、他のカンジダ属に使用することができます。と簡単に他の真菌に適応。メソッドは、複数のパラメータとバイオフィルム形成に影響を及ぼす要因を調べるために、複数の菌の分離株および/または変異株のバイオフィルム形成能を推定するために使用することができます。しかし、おそらく最も重要なことは、この方法では、バイオフィルム内の細胞の抗真菌薬感受性試験の決定のための非常に便利です。
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Disclosures
JLL - Rは、抗真菌剤を開発しているMicrobeHTSテクノロジーズ、（株）の株式を所有している。 MicrobeHTS Technologies社は、これらの研究のための財政的支援を提供していません。
Acknowledgments
実験室でのバイオフィルム関連の作業は、助成を受けた歯科＆頭蓋顔面研究とアレルギー感染症（JLL - Rに。）国立研究所の国立研究所からR21DE017294とR21AI080930の番号が付けられています。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIDCR、NIAIDまたはNIHの公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L. Candida biofilms: an update. Eukaryot Cell. 4, 633-638 (2005).
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
