Summary
Biz oluşumu için basit, hızlı ve sağlam bir bir yöntem tarif
Abstract
Candida albicans, şimdi ABD hastaneleri, üçüncü en sık görülen enfeksiyon bozukluğu olan hastalarda kandidiyazis ve genişleyen bir nüfus mantar enfeksiyonlarının en sık nedeni olmaya devam etmektedir . Kandidiyazis farklı tezahürleri biyofilm oluşumu, hem ev sahibi doku ve / veya tıbbi cihazlar (yani kateter) ile ilişkilidir. Biyofilm içinde hücrelerinin konağın immün yanıtları ve antifungallerin eylem korunur Biyofilm oluşumu, negatif klinik etkileri taşır. Biz C. oluşumu için, basit, hızlı ve güçlü bir in vitro model geliştirdik albicans biyofilm antifungal duyarlılık testi için de kullanılabilir 96 mikrotiter plakalar, biyofilm. Bu testte okuma, metabolik olarak aktif fungal biyofilm hücreleri tarafından XTT azaltılması (tetrazolium tuz) dayalı, kolorimetrik. Tipik bir deneyde, antifungal duyarlılık testi için ek bir 24 saat, biyofilm oluşumu için yaklaşık 24 saat sürer. Çünkü sadeliği ve yaygın olarak kullanılan laboratuar malzemeleri ve ekipman kullanımı, bu tekniğin, biyofilm araştırma democratizes ve antifungal duyarlılık testi mantar biyofilm standardizasyon doğru önemli bir adımı temsil etmektedir.
Protocol
1. C. hazırlanması albicans
C. albicans Risk Grubu 1/BSL1 mikroorganizma. Her zaman bu mikroorganizma ile çalışmak için iyi aseptik / steril teknikleri kullanmak ve biyolojik zararlı maddeleri uygun şekilde bertaraf edilmesi için kurumsal prosedürleri takip etmek hatırlıyorum.
- C. bir gecede kültür hazırlayın C tek bir koloni aşılanarak YPD (Maya Peptonlu Dekstroz) sıvı ortamda albicans YPD 25 ml içine albicans.
- 30 ° C gecede orbital çalkalayıcı (yaklaşık 180 rpm) kültür inkübe edin. En C. albicans suşlarının, bu koşullar altında maya hücreleri gibi büyüyecek.
- Santrifüj gecede kültürleri (yaklaşık 3000 rpm, 5-10 dakika), steril PBS ile iki kez hücreleri yıkayın ve RPMI 1640 ortamın pH 7.0 ve önceden ısıtılmış 165 mM morpholinepropanesulfonic asit ile tampon 20-25 ml nihai pelet tekrar süspansiyon 37 ° C (bu ortamda artık sadece "RPMI 1640" olarak anılacaktır).
- Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Sayımından sonra, 1.0 x 10 6 hücre / mL RPMI 1640 son bir yoğunlukta hücre süspansiyon hazırlamak.
Not: hücrelerinin toplu bir eğilim olduğundan, yıkamalar arasında ve pipetleme önce şiddetle vorteks önemlidir.
2. Biyofilm Oluşumu için 96-iyi microtiter Plaka Ayarlama
- Bir çok kanallı pipet kullanarak C. 100 mcL ekleyin 96-iyi mikrotiter plate (-s) seçilen kuyulara albicans süspansiyon. Bu negatif kontrol olarak hizmet verecek, sütun 12 kuyu hücreleri eklemek etmeyin.
- Kapak orijinal kapağı ile tüm mikrotiter plaka, mühür parafilm ile, 37, 24 saat için bir kuluçka ve inkübe içinde yer ° C. Inkübasyon süresi belirli deneysel tasarım adapte edilebilir. - 48 saat (yani 2, 4, 8, 12, 24 ve 48 saat) farklı zaman noktalarında birden fazla plakalar ekim ve her plaka işleme Örneğin, (24) bir süre üzerinde biyofilm oluşumu kinetiği incelemek mümkündür
- Biyofilm oluşumundan sonra, çok kanallı pipet kullanarak dikkatle kuyuların her birinde oluşan biyofilm gibi dokunmatik ve bozmak için değil orta aspirat.
- Bir çok kanallı pipet yıkama plakaları steril PBS (ortalama 200 mcL) üç kez kullanılması. Alternatif olarak, otomatik bir mikrotiter tabak yıkama kullanın. Yıkar yılları arasında, özellikle son yıkamadan sonra, herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için kağıt havlu ile blot ters bir pozisyonda plakaları boşaltın. Bu noktada kuyu alt kısmında oluşan biyofilm çıplak gözle bile açıkça görülebilir olmalı ve aynı zamanda ters bir mikroskop kullanılarak (Şekil 1) görüntülenebilmekte. Biyofilmler antifungal duyarlılık testi testleri için işlenmek üzere hazır.
(Deneyin temel amacı, biyofilm oluşumu ölçüde değerlendirmek için ise, plakaları kolorimetrik yöntemi kullanılarak işlenecek hazır. XTT / menodion reaktifi (bkz. Adım 3) Bunun için ortaya çıkan renk olabilir ) mikrotiter plate okuyucusu kullanılarak okunabilir.
3. Biyofilmler Antifungal duyarlılık testleri
- Stok solüsyonları veya toz, RPMI 1640 ortamında test edilecek her antifungal çalışan bir solüsyon hazırlanır. Tipik yüksek konsantrasyonu 1.024 mg / ml flukonazol için ve 16 mcg / ml amfoterisin B ve kaspofungin. Diğer konsantrasyonları farklı ajanlar için kullanılıyor olabilir.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak, mantar biyofilm içeren her mikrotiter plate 1. sütununda karşılık gelen kuyulara antifungal yüksek çalışma konsantrasyonu 200 mcL ekleyin.
- 2 - 10 sütunlar, her kuyuya RPMI 1640 100 mcL ekleyin.
- Sütun 11 kuyulara RPMI 1640 100 mcL ekleyin.
- Kolon 1 kuyulardan antifungal ajan 100 mcL çıkarın ve sütun 2 bitişik kuyuları (zaten 100 mcL orta içeren) ekleyin.
- Iyi bir seri katlanan seyreltme gerçekleştirmek için yukarı ve aşağı pipetleme içeriğini karıştırın ve ipuçları kaldırmak.
- Karıştırıldıktan sonra 10 sütun kuyulardan son 100 mcL hacmi atılır sonra sütun 10 kuyu, kadar doğru hareket tekrarlayın. Bu şekilde, bir dizi ilgi ajan (-ler) dilüsyonları iki katına, 10 sütun, kuyu en konsantre sütun 1 kuyu en çok konsantre gelen. 11 sütun rakipsiz biyofilm pozitif kontrol olarak görev yapacak ve 12 sütun boş kuyular negatif kontrol olarak görev yapacak.
- 37 kapaklar, 24 -48 saat parafilm ve inkübe mühür ile plakalar Kapak ° C
- Kuluçka döneminden sonra (3 x PBS) önce Adım 2.4 'gibi plakalar yıkayın.
- Bir çok kanallı pipet kullanarak arka plan X ölçümü için negatif kontrol kuyuları için iyi bir ön yıkanmış biyofilm içeren her yanı sıra 100 mcL XTT / menodion çözüm eklemekTT-kolorimetrik düzeyleri.
- XTT 0.5 g / L, 0.22 mikron gözenek boyutu filtre kullanarak filtre ile sterilize edilmiş olması gerekir steril Ringer laktat, PBS veya tuzlu doymuş bir çözüm olarak hazırlanmıştır. XTT çözümü ışığa karşı hassastır, bu yüzden hazırlanması sırasında alüminyum folyo ile kaplanmış olmalıdır. -70 Hazırlandıktan sonra ve filtre ile sterilize edilmiş 10 mL çalışma birimlere kısım, ve mağaza ° C Alüminyum folyo kullanarak ışık tüpleri koruyun. Kullanımdan hemen önce belirli bir deney için gerekli olarak birçok boru türü olarak sadece Çözülme.
- Menadiyon küçük hacimleri (yaklaşık 50 mcL) içine aliquoted ve -70 saklanan 100% aseton 10 mM stok solüsyonu ° C olarak hazırlanmıştır. 10 ml çözülmüş XTT çözüm içeren bir tüp menodion, stok solüsyonu 1 mcL ekleyerek, kullanımdan hemen önce XTT / menodion çözüm hazırlayın.
- 37, 2 saat süreyle karanlıkta alüminyum folyo ve inkübe plakaları Kapak ° C
- Plakalar ortaya çıkarın. Bir çok kanallı pipet kullanarak yeni bir mikrotiter plate ile ilgili kuyulara her iyi ve transfer renkli likit 80 mcL çıkarın.
- Mikrotiter plate okuyucusu 490 nm'de bir plaka (lar) ı okuyun.
- Kolorimetrik okumaları bir kontrol antifungal ilaç yokluğunda oluşan biyofilm karşılaştırma (bu durumda 11 sütun için değerler% 50 veya% 80 azalma tespit edildiği antifungal konsantrasyonları sesil minimum inhibitör konsantrasyonları SMIC50 ve SMIC80 hesaplayın , negatif kontrol), sadece XTT içeren sütun 12 kuyulardan değerleri çıkarmak için de hatırlıyorum. SMIC sonuçları bir tablo (yani birden fazla antifungaller karşı birden fazla izolatları) veya alternatif olarak, her antifungal karşı izole her bir mantar için antifungal konsantrasyonu yüzde inhibisyonu karşı komplo grafik olarak sunulabilir olarak sunulabilir.
Örnek: negatif kontrol değerleri çıkarılarak sonra, ortalama OD kontrolü sütun 11 oluşan biyofilm 1.32. SMIC50 az 1.32 x 50/100 = 0,66 Bu durumda, kolorimetrik okumaları>% 50 azalma önde gelen düşük antifungal konsantrasyon. Aynı şekilde SMIC80, bu durumda daha az 1.32 x 20/100 = 0.264, kolorimetrik okumaları>% 80 azalma önde gelen düşük antifungal konsantrasyon.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 C microphotograph albicans biyofilm ters bir mikroskop kullanılarak alınan bir 96 mikrotiter plate iyi bir alt kurdu. Şekil 2, her biri için bir C 11 biyofilm XTT kolorimetrik okumaları (OD 490 değerleri ) albicans vahşi tip suşu aynı 96 mikrotiter plate 8 farklı satırların her birinde kurdu. Şekil 3 amfoterisin B'nin C'ye karşı farklı konsantrasyonlarda faaliyet göstermektedir albicans biyofilm; oklar SMIC50 ve SMIC80 değerleri göstermektedir.
Şekil 1. (A) Panel A, C inverted mikroskop bağlı bir kamera ile alınan bir microphotograph gösterir albicans biyofilm RPMI orta ve müteakip yıkamalar PBS ile aspirasyon sonra kuyunun altındaki kurdu. Tipik bir C (B) mikrografı albicans biyofilm taramalı elektron mikroskobu kullanılarak görüntülendi. Barlar panelleri sırasıyla A ve B için 100 mikron ve 10 mikron.
Şekil 2. Birden fazla eşdeğer C Oluşumu 96-iyi microtiter plakalar albicans biyofilm bir C oluşturduğu biyofilm XTT-azaltma testleri Kolorimetrik okumaları (OD 490 değerleri) microtiter plakalar kuyularda albicans yabani türü. Değerler aynı 96 mikrotiter plate 8 farklı satırların her birinde oluşan 11 bağımsız biyofilm içindir. Farklı satırlar için tek yönlü varyans analizi ve sapmaların homojenlik ve Bonferroni çoklu karşılaştırma testi sonrası Bartlett testi kullanılarak karşılaştırıldı. (P> 0.05) her satır tüm çiftleri karşılaştırırken istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar tespit edildi.
Şekil 3. C'ye karşı antifungal duyarlılık testi tipik sonuçlar C biyofilm karşı farklı amfoterisin B konsantrasyonlarının etkinliği tipik sonuçlar betimleyen albicans biyofilm Grafik albicans vahşi tip süzün. Değerler ortalama yüzde kuyuları kontrol ile karşılaştırıldığında XTT azaltma deneyleri için kolorimetrik okuma olarak ifade edilir. SMIC50 ve SMIC80 değerleri oklarla gösterilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada XTT kullanarak biyofilm içinde hücrelerin metabolik faaliyetleri ölçen bir kolorimetrik yöntemi ile birleştiğinde Candida biyofilm oluşumu için, basit, hızlı, ekonomik ve yüksek tekrarlanabilir 96 mikrotiter plate modeli açıklanmaktadır . Bu biyofilm oluşumu için 96 iyi mikrotiter plate modeli C için geliştirilmiş. albicans, ancak diğer Candida türleri için kullanılabilir. ve diğer mantar organizmalar için kolayca adapte. Bu yöntem, birden fazla parametre ve biyofilm oluşumunu etkileyen faktörleri incelemek ve biyofilm oluşturan birden fazla mantar izolatları ve / veya mutant yeteneğini tahmin etmek için kullanılabilir. Ama belki de en önemlisi, bu yöntem, biyofilm içindeki hücrelerin antifungal duyarlılık testi belirlenmesi için çok yararlıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLL-R, antifungal ajanlar gelişmekte olan MicrobeHTS Technologies, Inc öz sermaye sahibi. MicrobeHTS Technologies, Inc bu çalışmalar için herhangi bir mali destek sağladı.
Acknowledgments
Laboratuvarda Biyofilm ilgili çalışmaları hibe tarafından finanse Diş ve Kraniofasial Araştırma ve Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar (JLL-R). Enstitüsü Ulusal Enstitüsü R21DE017294 ve R21AI080930 sayılı. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka NIDCR NIAID veya NIH resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L.
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
