96 microtiter ובכן פלייט מבוססי שיטה ליצירת ניטור ובדיקה של רגישות נגד פטריות קנדידה אלביקנס Biofilms

Summary

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת

Abstract

קנדידה אלביקנס נשאר הגורם השכיח ביותר של זיהומים פטרייתיים האוכלוסייה המתרחבת של חולים נפרץ קנדידה עכשיו את הזיהום השלישי בשכיחותו בבתי חולים בארה"ב. ביטויים שונים של קנדידה המשויכים היווצרות biofilm, הן רקמות המארח ו / או מכשירים רפואיים (כלומר צנתרים). היווצרות biofilm נושאת השלכות קליניות שליליות, כמו תאים בתוך biofilms מוגנים מפני תגובות מארח החיסונית מפעולה של antifungals. פיתחנו מודל במבחנה פשוטה, מהירה וחזקה ליצירת ג biofilms אלביקנס באמצעות 96 היטב microtiter צלחות, אשר יכול לשמש גם עבור בדיקות רגישות biofilm נגד פטריות. Readout של assay זה colorimetric, המבוססת על הפחתת XTT (מלח tetrazolium) על ידי תאים פעילים מבחינה מטבולית biofilm פטרייתי. ניסוי טיפוסי לוקח כ 24 שעות ליצירת biofilm, עם 24 שעות נוספות לצורך בדיקות רגישות נגד פטריות. בגלל הפשטות שלה, את השימוש בחומרים במעבדה זמין בדרך כלל ציוד, טכניקה זו democratizes מחקר biofilm מייצג צעד חשוב לקראת סטנדרטיזציה של בדיקות רגישות של פטריות biofilms פטרייתי.

Protocol

1. הכנת ג אלביקנס

ג אלביקנס היא קבוצת סיכון מיקרואורגניזם 1/BSL1. זכרו תמיד להשתמש בטכניקות aseptic / סטרילי טוב לעבוד עם בקטריה זו ופעל נהלים מוסדיים לסילוק נאות של חומרים Biohazard.

1. הכן את תרבות הלילה של C. אלביקנס בינוני (שמרים Peptone דקסטרוז) YPD נוזלי על ידי inoculating מושבה אחת של ג אלביקנס לתוך 25 מ"ל של YPD.
2. דגירה תרבות שייקר מסלולית (בערך 180 סל"ד) בשעה 30 ° C במשך הלילה. רוב ג אלביקנס זנים יגדלו כמו תאים שמרים בתנאים אלה.
3. צנטריפוגה התרבויות בין לילה (כ -3,000 סל"ד, 5-10 דקות), לשטוף את התאים פעמיים עם PBS סטרילי, resuspend את הכדור האחרון על 20-25 מ"ל של מדיום 1640 RPMI שנאגרו עם חומצה 165 mM morpholinepropanesulfonic עד 7.0 pH מראש חימם בשעה 37 ° C (מעתה והלאה המדיום הזה נקרא בפשטות "RPMI 1640").
4. ספירת תאים באמצעות hemacytometer. לאחר הספירה, להכין ההשעיה של תאים בצפיפות הסופי של 1.0 x 10 ⁶ תאים / מ"ל RPMI 1640.
   הערה: מאחר תאים יש נטייה צבירה, חשוב מערבולת במרץ בין כביסות ולפני pipetting.

2. הקמת 96-היטב פלייט microtiter להיווצרות של biofilm

1. בעזרת פיפטה רב להוסיף 100 μL של C. אלביקנס ההשעיה לתוך בארות נבחר הצלחת-96 גם microtiter (-s). אל תוסיף התאים בארות בעמודה 12, כמו אלה ישמש שולטת שלילית.
2. מכסים את הצלחת microtiter שלם עם מכסה המקורי, חותם עם parafilm, מקום בתוך החממה דגירה של 24 שעות ב 37 ° C. אורכו של הדגירה ניתן להתאים תכנון הניסוי הספציפי. לדוגמה, אפשר לבחון את קינטיקה של היווצרות biofilm על פני תקופה של 24-48 שעות על ידי זריעת הצלחות מרובות ועיבוד כל צלחת בנקודות זמן שונות (כלומר 2, 4, 8, 12, 24 ו - 48 ח)
3. לאחר היווצרות biofilm, בעזרת פיפטה רב לשאוב את המדיום בזהירות לא לגעת ולשבש את biofilms כי נוצרו בכל אחת הבארות.
4. בעזרת פיפטה רב צלחות לשטוף שלוש פעמים PBS סטרילית (200 μL לכל היטב). לחלופין, להשתמש מכונת כביסה אוטומטיות צלחת microtiter. בין שוטף, ובעיקר לאחר לשטוף האחרון, לנקז את צלחות בעמדה הפוכה על ידי סופג עם מגבות נייר כדי להסיר כל PBS שיורית. בנקודה זו נוצר biofilms בתחתית בארות צריך להיות לעין גם בעין בלתי מזוינת, ויכול גם להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ הפוך (איור 1). Biofilms מוכנים כעת להיות מעובד עבור מבחני רגישות בדיקות נגד פטריות.
   (אם המטרה העיקרית של הניסוי היא להעריך את מידת היווצרות biofilm, צלחות מוכנים להיות מעובד בשיטת colorimetric. לשם כך, מגיב XTT / menadione (ראה שלב 3 להלן), ניתן להוסיף את הצבע וכתוצאה מכך לקרוא באמצעות קורא צלחת microtiter).

3. בדיקה של רגישות נגד פטריות Biofilms

1. מ פתרונות מניות או אבקה, להכין פתרון עובד בינוני 1640 RPMI של פטריות כל להיבדק. ריכוזים גבוהים אופייניים 1,024 מיקרוגרם / מ"ל ​​עבור fluconazole, ו -16 מיקרוגרם / מ"ל ​​הן amphotericin B ו caspofungin. ריכוזים אחרים עשויים לשמש סוכנים שונים.
2. בעזרת טפטפת רב, להוסיף 200 μL של ריכוז גבוה של עובדים נגד פטריות על בארות המקביל בעמודה 1 של כל צלחת microtiter המכיל biofilms פטרייתי.
3. הוספת 100 μL של RPMI 1640 היטב כל בעמודות 2-10.
4. הוספת 100 μL של RPMI 1640 לבארות בעמודה 11.
5. הסר 100 μL של סוכן פטריות מבארות הטור 1 ולהוסיף את בארות הסמוך בעמודה 2 (כבר המכיל 100 μL של מדיום).
6. מערבבים היטב את תוכנו על ידי pipetting מעלה ומטה כדי לבצע דילול הכפלת סדרתי, ולהסיר את עצות.
7. חזור זז ימינה עד בארות הטור 10, שלאחריו נפח סופי 100 μL מבארות הטור 10 לאחר ערבוב נמחקת. בדרך זו, סדרה של דילולים הכפלה של הסוכן שלך (-ים) של עניין נוצרו; מן מרוכז רוב הבארות של טור 1 עד לפחות מרוכזת בארות של טור 10. Biofilms הבלתי מעורער בעמודה 11 ישמש שולטת חיובית, בארות ריק בעמודה 12 ישמש שולטת שלילית.
8. מכסים את הצלחות עם העפעפיים שלהם, חותם עם parafilm ו דגירה של 24 -48 שעות ב 37 ° C.
9. לאחר תקופת דגירה לשטוף את הצלחות כמו לפני שלב 2.4 (3 x PBS).
10. בעזרת פיפטה רב להוסיף 100 μL של פתרון XTT / menadione זה היטב המכיל biofilm מראש שטף כמו גם בארות שליטה שלילי למדידת רקע XTT-colorimetric רמות.
    1. XTT מוכן כפתרון רווי ב 0.5 g / L ב לקטט רינגר של סטרילית, PBS או תמיסת מלח, אשר צריך להיות פילטר עיקור באמצעות 0.22 מיקרומטר, מסנן גודל הנקבוביות. הפתרון XTT אור רגיש, כך זה צריך להיות מכוסה בנייר אלומיניום במהלך ההכנה. מוכן ברגע ולסנן-מעוקרים, aliquot תוך 10 כרכים עובד מ"ל, ולאחסן ב -70 ° C. הגנה על צינורות מן האור באמצעות רדיד אלומיניום. הפשירי רק צינורות רבים ככל הדרוש לניסוי מסוים רק לפני השימוש.
    2. Menadione מוכן כפתרון 10 mM המניות אצטון 100%, aliquoted לתוך נפח קטן יותר (כ - 50 μL) ומאוחסנים ב -70 ° C. הכן את הפתרון XTT / menadione רק לפני השימוש, על ידי הוספת 1 μL של פתרון המניות של menadione אל צינור המכיל 10 מ"ל של התמיסה XTT מופשר.
11. מכסים את הצלחות בנייר אלומיניום דגירה בחושך במשך שעות 2 ב 37 ° C.
12. לחשוף את הצלחות. בעזרת פיפטה רב להסיר 80 ​​μL של supernatant בצבע הנובע גם כל העברת לתוך בארות המקביל צלחת microtiter חדש.
13. קרא את צלחת (-ים) קורא microtiter צלחת ב 490 ננומטר.
14. חשב את ריכוזי נייחים מעכבות מינימום SMIC50 ו SMIC80, המהווים את ריכוזי פטריות בו ירידה של 50% או 80% בקריאה colorimetric מזוהים בהשוואה לשלוט biofilms שנוצר בהעדר תרופה נגד פטריות (במקרה זה הערכים עבור העמודה 11 , זכור גם לחסר ערכים שליליים שולטת מבארות בעמודה המכילה 12 XTT בלבד). תוצאות SMIC יכול להיות מוצג כטבלה (כלומר מבודד מרובים נגד antifungals מרובים) או לחילופין, התוצאות עבור כל פטרייתי הפרט לבודד נגד פטריות כל אחד יכול להיות מוצג בגרף על ידי התוויית עיכוב אחוז לעומת ריכוז פטריות.

דוגמה: לאחר הפחתת ערכי בבקרה שלילית, OD הממוצע של biofilms לשלוט נוצר בטור 11 הוא 1.32. SMIC50 הוא הריכוז הנמוך ביותר נגד פטריות מוביל להפחתה> 50% בקריאה colorimetric, במקרה הזה פחות מ 1.32 x 50 / 100 = 0.66. כמו כן, SMIC80 הוא הריכוז הנמוך ביותר נגד פטריות מוביל להפחתה> 80% בקריאה colorimetric, במקרה הזה פחות מ 1.32 x 20/100 = 0.264.

4. נציג תוצאות

איור 1 מציג microphotograph של C. אלביקנס biofilm נוצר בתחתית באר בצלחת 96 microtiter גם נלקח באמצעות מיקרוסקופ הפוכה. איור 2 מראה XTT-colorimetric קריאות (OD ₄₉₀ ערכים) עבור כל אחד 11 biofilms של C. זן אלביקנס סוג בר נוצרו בכל אחת 8 שורות שונות של צלחת 96 microtiter אותו היטב. איור 3 מראה את הפעילות של amphotericin B בריכוזים שונים נגד ג אלביקנס biofilms; החצים מצביעים SMIC50 ו SMIC80 ערכים.

באיור 1. (א) לוח מראה microphotograph נלקח באמצעות מצלמה מחוברת מיקרוסקופ הפוכה של C. אלביקנס biofilm נוצר בתחתית הבאר לאחר השאיפה של המדיום RPMI ו כביסות הבאים עם PBS. (ב) מיקרוסקופ של ג אופייני אלביקנס biofilm דמיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק. ברים הם 100 מיקרומטר ו 10 מיקרומטר עבור לוחות A ו-B בהתאמה.

איור 2. כינונה של C. המקבילה מרובים אלביקנס biofilms ב 96-היטב צלחות microtiter. קריאות Colorimetric (OD ₄₉₀ ערכים) מן XTT הפחתת מבחני של biofilms שהוקמה על ידי ג אלביקנס סוג בר בארות של צלחות microtiter. ערכים הם עבור 11 biofilms עצמאי שנוצר בכל אחת 8 שורות שונות של צלחת 96 microtiter אותו היטב. תוצאות עבור השורות שונה הושוו על ידי ניתוח חד סטרי השונות באמצעות בדיקה של ברטלט על ההומוגניות של שונויות והשוואה מרובים של Bonferroni שלאחר הבדיקה. ההבדלים לא היו משמעותיים מבחינה סטטיסטית ציין כאשר משווים את כל זוגות של שורות זה לזה (P> 0.05).

איור 3. תוצאות אופייניות של בדיקות רגישות נגד פטריות ג אלביקנס biofilms. גרף המתאר תוצאות אופייני היעילות של ריכוזים שונים amphotericin B נגד biofilms של C. אלביקנס זן פראי סוג. ערכים הם כפי שבאה לידי ביטוי בקריאה אחוזים בממוצע colorimetric עבור XTT הפחתת מבחני לעומת שליטה בארות. SMIC50 ו SMIC80 ערכים מסומנים על ידי חצים.

Discussion

כאן אנו מתארים פשוט, מהיר, חסכוני מאוד לשחזור 96 microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilms קנדידה בשילוב עם שיטת colorimetric אשר מודד את הפעילות המטבולית של תאים בתוך biofilm באמצעות XTT. 96 זה microtiter גם צלחת מודל להקמת biofilm פותחה במקור עבור ג אלביקנס אך יכול לשמש אחרים קנדידה spp. ומותאמת בקלות עבור אורגניזמים פטרייתיים אחרים. השיטה יכולה לשמש כדי לבחון פרמטרים רבים הגורמים המשפיעים על היווצרות biofilm ו לאמוד את היכולת של biofilm יוצרי מבודד פטרייתי מרובים ו / או זנים מוטנטיים. אבל אולי הכי חשוב, שיטה זו שימושית מאוד להגדרה של בדיקות רגישות פטריות של תאים בתוך biofilms.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud-dextrose agar	BD Biosciences	211584	To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose	US Biological	Y2076	Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine	Cellgro	50-020-PB	Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Buffer for washes
XTT sodium salt	Sigma-Aldrich	X4251	See above for preparation instructions
Ringer’s lactate	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	For preparation of XTT solution
Menadione	Sigma-Aldrich	M5625	Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12
15 ml conical centrifuge tubes	Corning	430790
50 ml conical centrifuge tubes	Corning	430828
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated	Corning	3595
Multichannel pipette and tips	Eppendorf
Incubator	Any Supplier
Microtiter plate reader	Any Supplier