Summary
نحن تصف طريقة بسيطة وسريعة وقوية لتشكيل
Abstract
المبيضات البيض يظل السبب الأكثر شيوعا للالتهابات فطرية في زيادة عدد السكان من المرضى للخطر والمبيضات الآن هو الثالث الأكثر شيوعا العدوى في المستشفيات في الولايات المتحدة. وترتبط مظاهر مختلفة من المبيضات مع تشكيل بيوفيلم ، سواء على أنسجة المضيف و / أو الأجهزة الطبية (القسطرة أي). تشكيل بيوفيلم دلالات سلبية السريرية ، ومحمية داخل خلايا الأغشية الحيوية من الاستجابات المناعية والمضيف من عمل مضادات الفطريات. وقد طورنا نموذجا بسيطا وسريعا وقويا في المختبر لتشكيل C. الأغشية الحيوية albicans به جيدا microtiter 96 لوحات ، والتي يمكن أن تستخدم أيضا لاختبار قابلية بيوفيلم مضاد. قراءات من هذا الاختبار هو اللونية ، على أساس الحد من XTT (أ tetrazolium الملح) بواسطة عملية الأيض نشطة بيوفيلم الخلايا الفطرية. تجربة نموذجية تأخذ ما يقرب من 24 ساعة لتشكيل بيوفيلم ، مع 24 ساعة إضافية لاختبار الحساسية المضادة للفطريات. بسبب بساطتها واستخدام المواد المتوفرة عادة المختبرات والمعدات ، وهذه التقنية نظاما ديمقراطيا البحوث بيوفيلم ويمثل خطوة مهمة نحو توحيد اختبار الحساسية من الفطريات الأغشية الفطرية.
Protocol
1. إعداد C. albicans
C. albicans هو مجموعة الكائنات الحية الدقيقة 1/BSL1 المخاطر. تذكر دائما أن حسن استخدام تقنيات العقيم / معقمة للعمل مع هذه الكائنات الدقيقة ومتابعة الإجراءات المؤسسية في مجال التخلص السليم من المواد بيولوجية.
- تعد الثقافة بين عشية وضحاها من C. albicans في المتوسط (الخميرة ببتون سكر العنب) YPD السائل ، فحقن مستعمرة واحدة من C. albicans الى 25 مل من YPD.
- الثقافة في احتضان شاكر المداري (حوالي 180 دورة في الدقيقة) عند 30 درجة مئوية خلال الليل. معظم جيم سوف albicans سلالات خلايا الخميرة تنمو في ظل هذه الظروف.
- الطرد المركزي الثقافات بين عشية وضحاها (حوالي 3000 دورة في الدقيقة ، 5-10 دقائق) ، وغسل خلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني العقيمة ، وresuspend الكرية النهائي في حوالي 20-25 مل من المتوسط 1640 RPMI مخزنة مع 165 ملم إلى 7.0 morpholinepropanesulfonic حامض درجة الحموضة وقبل تحسنت - في 37 (ويشار من الآن فصاعدا هذه الوسيلة لأنها "RPMI 1640" ببساطة) درجة مئوية.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. بعد الفرز ، وإعداد تعليق من الخلايا في مناطق ذات كثافة النهائي من 1.0 × 10 6 خلية / مل RPMI في عام 1640.
ملاحظة : نظرا لأن الخلايا لديهم ميل إلى تجميع ، فمن المهم أن دوامة بقوة بين الغسيل وقبل pipetting.
2. إعداد اللوحة 96 - جيدا Microtiter لتشكيل بيوفيلم
- باستخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميكرولتر من C. albicans تعليق في آبار مختارة من 96 لوحة microtiter جيدا (ليالي). لا تضيف إلى الخلايا في العمود 12 بئرا ، وهذه ستكون بمثابة الضوابط سلبية.
- تغطية لوحة microtiter كامل مع غطاء الأصلي ، مع ختم parafilm ، مكان داخل الحاضنة واحتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. ويمكن تكييف طول حضانة لتصميم التجريبية المحددة. على سبيل المثال ، فمن الممكن لدراسة حركية تشكيل بيوفيلم خلال الفترة من 24 -- 48 ساعة من قبل البذر لوحات متعددة وتجهيز كل لوحة في نقاط زمنية مختلفة (أي 2 ، 4 ، 8 ، 12 ، 24 و 48 ساعة)
- بعد تشكيل بيوفيلم ، وذلك باستخدام ماصة الأقنية نضح المتوسط بعناية حتى لا تلمس وتعطيل الأغشية الحيوية التي شكلت في كل من الآبار.
- استخدام لوحات متعددة ماصة يغسل ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني العقيمة (200 ميكرولتر لكل بئر). بدلا من ذلك ، استخدم لوحة microtiter غسالة آلية. بين يغسل ، وخصوصا بعد غسل الماضي ، واستنزاف لوحات في وضع مقلوب بواسطة النشاف مع المناشف الورقية لإزالة أي برنامج تلفزيوني المتبقية. في هذه النقطة يجب أن الأغشية الحيوية التي شكلت في الجزء السفلي من الآبار تكون مرئية بوضوح حتى بالعين المجردة ، ويمكن أيضا تصور باستخدام مجهر مقلوب (الشكل 1). الأغشية الحيوية هي الآن على استعداد لمعالجتها للفطريات المقايسات اختبار الحساسية.
(إذا كان الغرض الرئيسي من هذه التجربة هو تقييم مدى تشكيل بيوفيلم ، لوحات مستعدون لتتم معالجتها باستخدام الأسلوب اللونية ، ولهذا ، يمكن إضافة كاشف XTT / ميناديون (انظر الخطوة 3 أدناه) ، واللون الناتج قراءة باستخدام قارئ لوحة microtiter).
3. اختبار مضاد للحساسية الأغشية الحيوية
- من الحلول أو مسحوق الأوراق المالية ، وإعداد العاملين في حل المتوسط 1640 RPMI كل مضاد لفحصها. تركيزات عالية النموذجية هي 1024 ميكروغرام / مل لفلوكونازول ، و 16 ميكروغرام / مل لالأمفوتريسين B على حد سواء وcaspofungin. ويمكن استخدام تركيزات مختلفة أخرى عن وكلاء.
- باستخدام ماصة متعددة ، إضافة 200 ميكرولتر من ارتفاع تركيز عمل مضاد للآبار المناظرة في العمود 1 من كل لوحة تحتوي على microtiter الأغشية الفطرية.
- إضافة 100 ميكرولتر من 1640 إلى RPMI كل بئر في العمودين 2 إلى 10.
- إضافة 100 ميكرولتر من RPMI 1640 إلى الآبار في العمود 11.
- إزالة 100 ميكرولتر من عامل مضاد للفطريات من الآبار من العمود (1) وإضافة إلى الآبار المجاورة في العمود 2 (يحتوي بالفعل 100 ميكرولتر من المتوسط).
- مزيج جيد من قبل محتويات pipetting صعودا وهبوطا لإجراء التخفيف مضاعفة المسلسل ، وإزالة النصائح.
- كرر تحريك لليمين حتى آبار العمود 10 ، وبعد ذلك يتم تجاهل حجم النهائي 100 ميكرولتر من الآبار العمود 10 بعد الاختلاط. في هذا السبيل ، تم إنشاء سلسلة من التخفيفات مضاعفة من وكيلك (ليالي) في المصالح ؛ من معظم الآبار تتركز في العمود 1 إلى الأقل تتركز في العمود 10 من الآبار. والأغشية الحيوية دون منازع في العمود 11 بمثابة الضوابط الإيجابية ، والآبار الفارغة في العمود 12 ستكون بمثابة الضوابط سلبية.
- تغطي لوحات ذات الأغطية لهم ، وختم مع parafilm واحتضان لح -48 24 إلى 37 درجة مئوية.
- بعد فترة حضانة تغسل الصحون كما في الخطوة قبل 2.4 (PBS × 3).
- باستخدام ماصة الأقنية إضافة 100 ميكرولتر من XTT / ميناديون حل لتحتوي كل منها على بئر بيوفيلم قبل غسلها وكذلك آبار المراقبة السلبية لقياس X الخلفيةTT - اللونية المستويات.
- مستعدة XTT كحل المشبعة بنسبة 0.5 غرام / لتر في اكتات رينغر العقيمة ، وبرنامج تلفزيوني أو المالحة ، الذي يحتاج الى تعقيم فلتر تصفية باستخدام 0.22 ميكرون ، حجم المسام. الحل هو ضوء XTT الحساسة ، ولذلك يجب تغطيتها بورق الألمنيوم أثناء التحضير. أعدت مرة واحدة وتعقيم فلتر ، قسامة في أحجام 10 مل العمل ، وتخزينها في -70 درجة مئوية. حماية الأنابيب من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم. ذوبان الجليد فقط على العديد من الأنابيب اللازمة لإجراء تجربة معينة فقط قبل استخدامه.
- مستعدة ميناديون كحل ملي الأسهم 10 في الاسيتون 100 ٪ ، إلى أصغر حجم aliquoted (حوالي 50 ميكرولتر) وتخزينها في -70 درجة مئوية. إعداد الحل XTT / ميناديون فقط قبل استخدامه ، وذلك بإضافة 1 ميكرولتر من محلول المخزون من ميناديون لأنبوب تحتوي على 10 مل من محلول XTT المذوبة.
- تغطي لوحات في رقائق الألومنيوم واحتضان في الظلام لمدة 2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تكشف لوحات. باستخدام ماصة الأقنية إزالة 80 ميكرولتر من طاف الملونة الناتجة من كل بئر ونقل في المقابل من الآبار لوحة microtiter جديدة.
- قراءة لوحة (ليالي) في لوحة microtiter قارئ في 490 نانومتر.
- حساب الحد الأدنى لاطئة تركيزات المثبطة SMIC50 وSMIC80 ، والتي هي تجمعات الفطريات التي يتم فيها الكشف عن انخفاض بنسبة 50 ٪ أو 80 ٪ في قراءات في المقارنة اللونية لسيطرة الأغشية الحيوية التي شكلت في غياب الدواء مضاد للفطريات (في هذه الحالة قيم العمود 11 ، وتذكر أيضا أن طرح القيم السلبية من الضوابط من الآبار التي تحتوي على 12 في العمود XTT فقط). ويمكن عرض النتائج SMIC كجدول (عزلة متعددة ضد أي مضادات الفطريات متعددة) أو بدلا من ذلك ، يمكن تقديم النتائج لكل فرد الفطرية عزل ضد بعضها مضاد للفطريات مثل رسم بياني عن طريق تثبيط بالتآمر في المئة مقابل تركيز الفطريات.
مثلا : بعد طرح القيم السلبية في السيطرة ، والتطوير التنظيمي متوسط الأغشية الحيوية التي تشكلت في السيطرة العمود 11 هو 1.32. وSMIC50 هو أدنى تركيز الفطريات التي تؤدي إلى الحد من> 50 ٪ في القراءات اللونية ، في هذه الحالة أقل من 1.32 X 50 / 100 = 0.66. وبالمثل ، فإن SMIC80 هو أدنى تركيز الفطريات التي تؤدي إلى الحد من> 80 ٪ في القراءات اللونية ، في هذه الحالة أقل من 1.32 X 0.264 = 20/100.
4. ممثل النتائج
الشكل 1 يبين microphotograph لجيم شكلت albicans بيوفيلم على الجزء السفلي من بئر في لوحة 96 microtiter كذلك اتخذت باستخدام مجهر مقلوب. ويبين الشكل 2 - XTT اللونية قراءات (OD 490 القيم) لكل واحد من 11 من الأغشية الحيوية C. albicans نوع السلالة البرية التي تشكلت في كل من الصفوف 8 مختلفة من نفس لوحة 96 microtiter جيدا. الشكل 3 يبين نشاط الأمفوتريسين B بتركيزات مختلفة ضد C. albicans الأغشية الحيوية ؛ تشير الأسهم SMIC50 SMIC80 والقيم.
الشكل 1 (أ) لوحة ويظهر microphotograph التي يتم التقاطها باستخدام كاميرا مثبتة على مجهر مقلوب لجيم albicans بيوفيلم تشكلت على قاع البئر بعد تطلع RPMI المتوسطة وغسيل لاحقة مع برنامج تلفزيوني. (ب) صورة مجهرية لجيم نموذجية تصور albicans بيوفيلم باستخدام المجهر الإلكتروني. الحانات هي 100 ميكرون وميكرون (10) لوحات A و B على التوالي.
الشكل 2. تشكيل جيم يعادل متعددة albicans الأغشية الحيوية في 96 - جيدا لوحات microtiter. اللونية قراءات (OD 490 القيم) من XTT الحد من الأغشية الحيوية المقايسات التي شكلتها C. albicans النوع البري في الآبار لوحات microtiter. القيم هي لمدة 11 الأغشية الحيوية المستقلة التي تشكلت في كل من 8 صفوف مختلفة من نفس لوحة 96 microtiter جيدا. وتمت مقارنة النتائج للصفوف مختلفة في اتجاه واحد ، وتحليل التباين باستخدام اختبار بارتليت للتجانس الفروق والمقارنة وBonferroni المتعددة في مرحلة ما بعد الاختبار. ولم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية عند المقارنة بين كل زوج من الصفوف لبعضها البعض (P> 0.05).
الشكل 3. نموذجي نتائج اختبارات الحساسية ضد الفطريات C. albicans الأغشية الحيوية. رسم بياني يصور النتائج النموذجية لفعالية تركيزات مختلفة من الأغشية الحيوية ضد الأمفوتريسين B لجيم albicans نوع السلالة البرية. كما يتم التعبير عن القيم اللونية قراءات في المئة في المتوسط للحد من المقايسات XTT مقارنة للسيطرة على الآبار. ويشار إلى SMIC50 SMIC80 القيم السهام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
نحن هنا وصف بسيط وسريع والاقتصادية واستنساخه غاية 96 لوحة microtiter نموذج جيد لتشكيل الأغشية الحيوية المبيضات مقرونا اللونية الأسلوب الذي يقيس النشاطات الأيضية من الخلايا داخل بيوفيلم XTT به. وقد تم تطوير هذا الأصل 96 لوحة microtiter كذلك نموذجا لتشكيل بيوفيلم لجيم ويمكن استخدام albicans ولكن لSPP المبيضات الأخرى. وتكييفها بسهولة للكائنات الفطرية الأخرى. ويمكن استخدام هذه الطريقة لفحص معلمات متعددة والعوامل المؤثرة في تشكيل بيوفيلم وتقدير قدرة بيوفيلم تشكيل من العزلات الفطرية متعددة و / أو سلالات متحولة. ولكن ربما كان الأهم من ذلك ، وهذه الطريقة مفيدة جدا لتحديد اختبار الحساسية للمضاد للخلايا داخل الأغشية الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
JLL - R تملك الأسهم في شركة MicrobeHTS ، التكنولوجيات ، وهو مضاد للفطريات وكلاء النامية. قدمت MicrobeHTS تكنولوجيز ، وشركة أي دعم مالي لهذه الدراسات.
Acknowledgments
ويتم تمويل بيوفيلم ذات الصلة العمل في المختبر من المنح ومرقمة R21DE017294 R21AI080930 من المعهد الوطني لأبحاث طب الأسنان والجمجمة ، والمعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (لJLL - R). المحتوى هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للNIDCR ، NIAID أو في المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
- Bachmann, S. P. In vitro activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3591-3596 (2002).
- Hawser, S. P., Norris, H., Jessup, C. J., Ghannoum, M. A. Comparison of a 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)carbonyl]-2H-t etrazolium hydroxide (XTT) colorimetric method with the standardized National Committee for Clinical Laboratory Standards method of testing clinical yeast isolates for susceptibility to antifungal agents. J Clin Microbiol. 36, 1450-1452 (1998).
- Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. J Clin Microbiol. 41, 506-508 (2003).
- Kuhn, D. M., George, T., Chandra, J., Mukherjee, P. K., Ghannoum, M. A. Antifungal susceptibility of Candida biofilms: Unique efficacy of amphotericin B lipid formulations and echinocandins. Antimicrob. Agents Chemother. 46, 1773-1780 (2002).
- Nobile, C. J., Mitchell, A. P. C. albicans transcription factor Bcr1p: a regulator of cell-surface genes and biofilm formation. Current Biol. 15, 1150-1155 (2005).
- Ramage, G., Saville, S. P., Thomas, D. P., Lopez-Ribot, J. L.
- Ramage, G., Vande Walle, K., Wickes, B. L., p, B. L., Lopez-Ribot, J. L. Standardized method for in vitro antifungal susceptibility testing of Candida albicans biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 45, 2475-2479 (2001).
- Bachmann, S. P. Antifungal combinations against Candida albicans biofilms in vitro. Antimicrob Agents Chemother. 47, 3657-3659 (2003).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Bachmann, S. P., Wickes, B. L., Lopez-Ribot, J. L. In vitro pharmacodynamic properties of three antifungal agents against preformed Candida albicans biofilms determined by time-kill studies. Antimicrob Agents Chemother. 46, 3634-3636 (2002).
- Ramage, G., VandeWalle, K., Wickes, B. L., López-Ribot, J. L. Characteristics of biofilm formation by Candida albicans. Rev. Iberoam. Micol. 18, 163-170 (2001).
- Tellier, R., Krajden, M., Grigoriew, G. A., Campbell, I. Innovative endpoint determination system for antifungal susceptibility testing of yeasts. Antimicrob Agents Chemother. 36, 1619-1625 (1992).
- Nett, J., Andes, D. Candida albicans biofilm development, modeling a host-pathogen interaction. Curr Opin Microbiol. 9, 340-345 (2006).
