Summary
Descriviamo un metodo semplice, rapido e robusto per la formazione di
Abstract
Candida albicans rimane la causa più frequente di infezioni fungine in una popolazione in espansione di pazienti compromessi e candidosi è ora la terza più comune infezione negli ospedali degli Stati Uniti. Diverse manifestazioni della candidiasi sono associati con la formazione di biofilm, sia su tessuti dell'ospite e / o dispositivi medici (cateteri per esempio). Formazione di biofilm svolge negative implicazioni cliniche, come le cellule all'interno del biofilm sono protetti dalla risposta immunitaria e dall'azione di antimicotici. Abbiamo sviluppato un modello semplice, veloce e robusto in vitro per la formazione di C. biofilm albicans con 96 pozzetti per microtitolazione piastre, che può anche essere utilizzato per test di suscettibilità biofilm antimicotico. La lettura di questo saggio è colorimetrico, basato sulla riduzione delle XTT (un sale di tetrazolio) da cellule metabolicamente attive biofilm fungine. Un tipico esperimento dura circa 24 ore per la formazione di biofilm, con ulteriori 24 ore per i test di suscettibilità antifungina. A causa della sua semplicità e l'utilizzo di materiali di laboratorio e attrezzature comunemente disponibili, questa tecnica democratizza ricerca biofilm e rappresenta un passo importante verso la standardizzazione dei test di suscettibilità antifungina di biofilm fungine.
Protocol
1. Preparazione di C. albicans
C. albicans è un microrganismo Group Risk 1/BSL1. Ricordate sempre di usare buone tecniche asettiche / sterile per lavorare con questo microrganismo e seguire le procedure istituzionali per il corretto smaltimento dei materiali a rischio biologico.
- Preparare una cultura durante la notte di C. albicans in YPD (Lievito peptone destrosio) mezzo liquido inoculando una singola colonia di C. albicans in 25 ml di YPD.
- Incubare cultura in un agitatore orbitale (circa 180 giri al minuto) a 30 ° C durante la notte. La maggior parte C. albicans ceppi crescerà come cellule di lievito in queste condizioni.
- Centrifugare le culture durante la notte (circa 3.000 rpm, 5-10 minuti), lavare le cellule due volte con PBS sterile e risospendere il pellet in finale di circa 20-25 ml di RPMI 1640 medium tamponato con l'acido mm 165 morpholinepropanesulfonic a pH 7,0 e pre-riscaldata a 37 ° C (da ora in poi questo mezzo è definita semplicemente come "RPMI 1640").
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro. Dopo il conteggio, preparare una sospensione di cellule ad una densità finale di 1,0 x 10 6 cellule / ml in RPMI 1640.
Nota: Poiché le cellule hanno la tendenza ad aggregarsi, è importante vortice vigorosamente tra lavaggi e prima di pipettaggio.
2. Impostazione del 96-ben micropiastra per la formazione del biofilm
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di C. sospensione albicans nei pozzetti selezionate del-96 e micropiastra (-s). Non aggiungere alle cellule di pozzi in colonna 12, in quanto questi serviranno come controlli negativi.
- Coprire l'intera piastra microtiter con il suo coperchio originale, sigillare con parafilm, posto all'interno di un incubatore e incubare per 24 ore a 37 ° C. La lunghezza di incubazione può essere adattata alla struttura specifica sperimentale. Per esempio, è possibile esaminare la cinetica della formazione di biofilm in un periodo di 24 - 48 ore dalla semina placche multiple e l'elaborazione di un piatto in momenti diversi (es. 2, 4, 8, 12, 24 e 48 ore)
- Dopo la formazione di biofilm, utilizzando una pipetta multicanale aspirare il terreno con attenzione per non toccare e disturbare il biofilm che si sono formati in ciascuno dei pozzi.
- Usando una pipetta lavare piatti multicanale tre volte in PBS sterile (200 ul per pozzetto). In alternativa, utilizzare un sistema automatico lavaggio micropiastra. Tra un lavaggio, e in particolare dopo l'ultimo lavaggio, le piastre di scarico in posizione invertita tamponando con carta assorbente per eliminare ogni residuo PBS. A questo punto biofilm formato sul fondo dei pozzetti deve essere chiaramente visibile anche ad occhio nudo e possono anche essere visualizzati utilizzando un microscopio invertito (Figura 1). Biofilm sono ora pronti per essere elaborati per le analisi antimicotico test di sensibilità.
(Se lo scopo principale dell'esperimento è quello di valutare l'entità della formazione di biofilm, i piatti sono pronti per essere trattati con il metodo colorimetrico. Per questo, il XTT / menadione reagente (vedi punto 3 di seguito) possono essere aggiunti e il colore risultante letti utilizzando un lettore di micropiastra).
3. Test di suscettibilità antifungina di biofilm
- Dalle soluzioni stock o in polvere, preparare una soluzione di lavoro in RPMI 1640 medium di ogni antimicotico da testare. Tipici livelli di concentrazione elevati 1.024 mg / ml per fluconazolo, e 16 mg / ml per entrambe le amfotericina B e caspofungin. Altre concentrazioni possono essere utilizzati per diversi agenti.
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 200 microlitri della alta concentrazione di lavoro antimicotica nei pozzetti corrispondenti nella colonna 1 di ogni micropiastra contenente biofilm fungine.
- Aggiungere 100 ml di RPMI 1640 in ciascun pozzetto in colonne da 2 a 10.
- Aggiungere 100 ml di RPMI 1640 ai pozzi nella colonna 11.
- Rimuovere 100 l di agente antimicotico dai pozzetti di colonna 1 e aggiungere ai pozzetti delle colonne 2 (già contenente 100 ml di media).
- Mescolare il contenuto ben pipettando su e giù per eseguire una diluizione seriale raddoppio, e rimuovere le punte.
- Ripetere il movimento a destra fino a quando i pozzi di colonna 10, dopo di che viene eliminato l'ultimo volume di 100 microlitri dai pozzetti della colonna 10 dopo la miscelazione. In questo modo, una serie di doppie diluizioni del vostro agente (-s) di interesse sono stati creati, da più concentrata in pozzetti di colonna 1 al meno concentrato in pozzetti di colonna 10. Biofilm incontrastato nella colonna 11 serviranno come controlli positivi, e pozzi vuoti nella colonna 12 serviranno come controlli negativi.
- Coprire le piastre con i loro coperchi, sigillare con parafilm e incubare per 24 -48 ore a 37 ° C.
- Dopo il periodo di incubazione lavare i piatti, come nel passo 2,4 prima (3 x PBS).
- Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 100 ml di XTT / menadione soluzione in ogni pozzetto contenente una pre-lavati biofilm nonché di pozzetti di controllo negativo per la misura di X sfondoTT-colorimetrico livelli.
- Il XTT è pronta come una soluzione satura a 0,5 g / L in sterile di Ringer lattato, PBS o soluzione salina, che deve essere sterilizzata per filtrazione con un 0,22 micron, dimensioni dei pori del filtro. La soluzione XTT è sensibile alla luce, quindi dovrebbe essere coperto con un foglio di alluminio durante la preparazione. Una volta preparato e sterilizzata per filtrazione, aliquota in 10 ml di volume di lavoro, e conservare a -70 ° C. Proteggere i tubi di luce utilizzando un foglio di alluminio. Scongelare solo come tubi quante necessarie per un particolare esperimento appena prima dell'uso.
- Menadione è pronta come una soluzione al 10 mM magazzino in 100% acetone, frazionare in piccoli volumi (circa 50 mL) e conservati a -70 ° C. Preparare il XTT / menadione soluzione al momento dell'uso, con l'aggiunta di 1 ml di soluzione madre di menadione in una provetta contenente 10 mL della soluzione XTT scongelati.
- Coprire le piastre in alluminio ed incubare al buio per 2 ore a 37 ° C.
- Scoprire i piatti. Utilizzando una pipetta multicanale eliminare l'80 l di supernatante risultante colorate da ogni pozzetto e trasferire nei pozzetti corrispondenti della micropiastra nuovo.
- Leggere la piastra (-s) in un lettore di micropiastre a 490 nm.
- Calcolare il sessili concentrazioni minime inibenti SMIC50 e SMIC80, che sono le concentrazioni antimicotico in cui vengono rilevati il 50% o 80% di diminuzione nella lettura colorimetrica in confronto al controllo biofilm formati in assenza di farmaci antifungini (in questo caso i valori di colonna 11 , ricordate anche per sottrarre i valori da controlli negativi da pozzi nella colonna 12 contenente XTT solo). Risultati SMIC può essere presentato come una tabella (isola cioè multipla nei confronti delle antimicotici multipla) o, in alternativa, i risultati per ogni singolo fungine isolare l'uno contro l'antimicotico può essere presentato come un grafico disegnando inibizione per cento rispetto concentrazione antimicotico.
Esempio: Dopo aver sottratto i valori del controllo negativo, il valore medio dei biofilm di controllo formata in colonna 11 è 1,32. Il SMIC50 è la più bassa concentrazione antimicotico che porta ad una riduzione> 50% nelle letture colorimetrici, in questo caso meno di 1,32 x 50/100 = 0.66. Allo stesso modo, il SMIC80 è la più bassa concentrazione antimicotico che porta ad una riduzione> 80% nelle letture colorimetrici, in questo caso meno di 1,32 x 20/100 = 0,264.
4. Rappresentante Risultati
La figura 1 mostra una Microfotografia di una C. albicans biofilm formato sul fondo di un pozzo in una piastra da 96 microtitolazione preso bene utilizzando un microscopio invertito. La Figura 2 mostra XTT-colorimetrico letture (OD 490 valori) per ciascuna di 11 biofilm di C. ceppo di tipo selvatico albicans formate in ciascuna delle 8 righe diverse dello stesso 96 micropiastra bene. La figura 3 mostra l'attività di amfotericina B in funzione della concentrazione contro C. albicans biofilm; frecce indicano SMIC50 e SMIC80 valori.
Figura 1. (A) Un pannello mostra un Microfotografia scattate con una videocamera collegata ad un microscopio invertito di C. albicans biofilm formata sul fondo del pozzo dopo l'aspirazione di medie RPMI e successivi lavaggi con PBS. (B) Una microfotografia di un tipico C. albicans biofilm visualizzati usando la microscopia elettronica a scansione. I bar sono 100 micron e 10 micron per i pannelli A e B rispettivamente.
Figura 2. Formazione di molteplici equivalente C. albicans biofilm in piastre da 96 pozzetti microtiter. letture colorimetriche (OD 490 valori) da XTT riduzione analisi dei biofilm formato da una C. albicans tipo selvatico in pozzetti di piastre microtiter. I valori sono per 11 biofilm indipendente formata in ciascuna delle 8 righe diverse dello stesso 96 micropiastra bene. Risultati per le varie file sono stati confrontati con una analisi della varianza e utilizzando il test della Bartlett per l'omogeneità delle varianze e confronto multiplo del Bonferroni post-test. Nessuna differenza statisticamente significativa è stata notata nel confronto tra tutte le coppie di righe tra loro (p> 0,05).
Figura 3. Risultati tipici di test di suscettibilità antifungina contro C. albicans biofilm. grafico raffigurante risultati tipici della efficacia di differenti concentrazioni di amfotericina B contro i biofilm di C. albicans ceppo selvatico. I valori sono espressi come valori colorimetrici per cento in media d'XTT riduzione test rispetto al controllo pozzi. SMIC50 e SMIC80 valori sono indicati da frecce.
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Discussion
Qui si descrive un semplice, rapido, economico e altamente riproducibili 96 pozzetti modello micropiastre per la formazione di biofilm Candida accoppiato con un metodo colorimetrico che misura l'attività metabolica delle cellule all'interno del biofilm utilizzando XTT. Questo modello ben 96 micropiastre per la formazione di biofilm è stato originariamente sviluppato per C. albicans ma può essere utilizzato per altre Candida spp. e facilmente adattato per altri organismi fungini. Il metodo può essere utilizzato per esaminare più parametri e fattori che influenzano la formazione di biofilm e di stimare la capacità di formazione di biofilm di molteplici ceppi fungini e / o ceppi mutanti. Ma forse più importante, questo metodo è molto utile per la determinazione del test di suscettibilità antifungina di cellule all'interno di biofilm.
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Disclosures
JLL-R possiede partecipazioni in MicrobeHTS Technologies, Inc., che sta sviluppando agenti antifungini. MicrobeHTS Technologies, Inc. ha fornito alcun supporto finanziario per questi studi.
Acknowledgments
Biofilm attività relative al laboratorio è finanziata da sovvenzioni numerati R21DE017294 e R21AI080930 dal National Institute of Dental Research & cranio-facciali e l'Istituto nazionale per le allergie e malattie infettive (a JLL-R.). I contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale della NIDCR, il NIAID o il NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sabouraud-dextrose agar | BD Biosciences | 211584 | To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates |
| YPD: Yeast peptone dextrose | US Biological | Y2076 | Medium for propagation of overnight liquid cultures |
| RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine | Cellgro | 50-020-PB | Liquid medium for biofilm formation |
| Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS) | Fisher Scientific | BP308 | To buffer RPMI 1640 |
| Phosphate buffered saline, PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Buffer for washes |
| XTT sodium salt | Sigma-Aldrich | X4251 | See above for preparation instructions |
| Ringer’s lactate | Hospira Inc. | NDC0409-7953-09 | For preparation of XTT solution |
| Menadione | Sigma-Aldrich | M5625 | Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion |
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| 15 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430790 | |
| 50 ml conical centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
| 96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated | Corning | 3595 | |
| Multichannel pipette and tips | Eppendorf | ||
| Incubator | Any Supplier | ||
| Microtiter plate reader | Any Supplier |
References
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