En 96 Väl mikrotiterplatta-baserad metod för övervakning Bildning och svampdödande resistensbestämning av Candida albicans Biofilmer

Summary

Vi beskriver en enkel, snabb och robust metod för bildandet av

Abstract

Candida albicans är den vanligaste orsaken till svampinfektioner hos en växande befolkning av komprometterade patienter och candidiasis är nu den tredje vanligaste infektionen i amerikanska sjukhus. Olika manifestationer av candidiasis är förknippade med biofilm bildning, både på värd vävnader och / eller medicinsk utrustning (dvs katetrar). Biofilm bildning bär negativa kliniska konsekvenser som celler i biofilmen är skyddade från värd immunsvaret och från effekten av antimykotika. Vi har utvecklat en enkel, snabb och robust in vitro modell för bildandet av C. albicans biofilmer med 96 väl mikrotiter-plattor, som även kan användas för biofilmen svamp resistensbestämning. Avläsningen av denna analys är kolorimetriska, baserat på minskningen av XTT (ett tetrazolium salt) av metaboliskt aktiva svamp biofilm celler. En typisk experiment tar ungefär 24 h för biofilm formation, med ytterligare 24 h för svampdödande resistensbestämning. På grund av dess enkelhet och användandet av vanliga laboratorie material och utrustning, democratizes denna teknik biofilm forskning och är ett viktigt steg mot standardisering av svampdödande resistensbestämning av svamp biofilmer.

Protocol

1. Beredning av C. albicans

C. albicans är en riskgrupp 1/BSL1 mikroorganism. Kom ihåg att alltid använda bra aseptisk / sterila tekniker för arbete med denna mikroorganism och följa de institutionella rutiner för korrekt hantering av biologiskt material.

1. Förbered en övernattning kultur av C. albicans i YPD (jäst, pepton dextros) vätska genom inokulering av en enda koloni av C. albicans i 25 mL YPD.
2. Inkubera kultur i en skakapparat (ca 180 rpm) vid 30 ° C över natten. De flesta C. albicans stammar kommer att växa som jästceller under dessa förhållanden.
3. Centrifugera natten kulturer (ca 3.000 rpm, 5-10 minuter), tvätta cellerna två gånger med sterilt PBS, och återsuspendera sista pelleten i ca 20-25 ml RPMI 1640 mediet buffras med 165 mm morpholinepropanesulfonic syra till pH 7,0 och förvärmda vid 37 ° C (från och med nu på detta medium kallas helt enkelt "RPMI 1640").
4. Räkna celler med en hemacytometer. Efter att ha räknat, Bered en suspension av celler vid en slutlig densitet på 1,0 x 10 ⁶ celler / ml i RPMI 1640.
   OBS: Eftersom cellerna har en tendens att aggregera, är det viktigt att virvel kraftigt mellan tvättar och före pipettering.

2. Ställa in 96-bra mikrotiterplatta för bildandet av biofilm

1. Med hjälp av en flerkanalspipett lägga 100 mikroliter av C. albicans suspensionen i utvalda brunnar i 96-håls mikrotiterplatta (-er). Lägg inte till celler brunnar i kolumn 12, eftersom dessa kommer att fungera som negativa kontroller.
2. Täck hela mikrotiterplattan med sin ursprungliga lock, tätning med parafilm, placera inne en inkubator och inkubera i 24 timmar vid 37 ° C. Längden på inkubationstiden kan anpassas till de specifika experimentell design. Till exempel är det möjligt att undersöka kinetiken av biofilm bildas under en period på 24 - 48 timmar genom att seeda flera plattor och bearbetning varje platta vid olika tidpunkter (dvs 2, 4, 8, 12, 24 och 48 h)
3. Efter biofilm bildas, med hjälp av en flerkanalspipett aspirera på medellång försiktigt för att inte beröra och störa biofilmer som har bildats i varje brunn.
4. Med hjälp av en flerkanalspipett Tvätta plattorna tre gånger i sterila PBS (200 mikroliter per brunn). Du kan också använda en automatiserad bricka mikrotiterplattan. Mellan tvättar, och särskilt efter den sista tvättningen, avlopp plattorna i en inverterad position genom blotting med hushållspapper för att avlägsna alla rester PBS. Vid denna punkt biofilmer som bildas på botten av brunnarna ska vara klart synliga även med blotta ögat och kan också visualiseras med ett inverterat mikroskop (Figur 1). Biofilmer är nu redo att behandlas för svamp analyser resistensbestämning.
   (Om det huvudsakliga syftet med försöket är att bedöma omfattningen av biofilm bildning, plattorna är redo att bearbetas med kolorimetriska metoden. För detta kan XTT / menadion reagens (se steg 3 nedan) läggas till och den resulterande färgen läsas med en läsare mikrotiterplatta).

3. Svampdödande resistensbestämning av Biofilmer

1. Från stamlösningar eller pulver, förbereda en fungerande lösning i RPMI 1640 medelstora varje antimykotisk som ska testas. Typiska höga koncentrationer 1024 mikrogram / ml för flukonazol, och 16 mikrogram / ml för både amfotericin B och caspofungin. Andra koncentrationer kan användas för olika agenter.
2. Med hjälp av en flerkanalspipett, tillsätt 200 ìl av högt arbetstryck koncentrationen av antimykotisk till motsvarande brunnar i kolumn 1 i varje mikrotiterplatta innehåller svamp biofilmer.
3. Tillsätt 100 mikroliter av RPMI 1640 till varje brunn i kolumnerna 2 till 10.
4. Tillsätt 100 mikroliter av RPMI 1640 till brunnar i kolumn 11.
5. Ta bort 100 mikroliter av antimykotika från brunnarna av kolumn 1 och lägga till intilliggande brunnar i kolumn 2 (som redan innehåller 100 mikroliter av medium).
6. Blanda innehållet väl genom att pipettera upp och ned för att utföra en serie fördubbling utspädning och ta bort tips.
7. Upprepa går ända fram till brunnar i kolumn 10, varefter den slutliga 100 mikroliter volym från brunnarna i kolumn 10 efter blandning är kasseras. På detta sätt har en rad fördubbling utspädningar av din agent (-er) av intresse skapats, från de flesta koncentrerade till brunnar i kolumn 1 till minst koncentrerad till brunnar i kolumn 10. Oemotsagda biofilmer i kolumn 11 kommer att fungera som positiva kontroller och tomma brunnar i kolumn 12 kommer att tjäna som negativa kontroller.
8. Täck plattorna med sina lock, tätning med parafilm och inkubera i 24 -48 timmar vid 37 ° C.
9. Efter inkubationstiden Tvätta plattorna i steg 2,4 innan (3 x PBS).
10. Med hjälp av en flerkanalspipett lägga 100 mikroliter av XTT / menadion lösning till varje brunn som innehåller en förtvättad biofilm samt negativ kontroll brunnar för mätning av bakgrunden XTT-kolorimetriska nivåer.
    1. Den XTT framställs som en mättad lösning på 0,5 g / L i steril Ringer-laktat, PBS eller koksalt, som måste filter-steriliseras med en 0,22 ìm-porstorlek filter. Den XTT Lösningen är ljuskänslig, så det bör täckas med aluminiumfolie under beredning. Efter beredning och filter-steriliserade, uppmätt till 10 ml arbetar volymer, och förvara vid -70 ° C. Skydda rören från ljus med hjälp av aluminiumfolie. Tina bara så många rör som behövs för ett visst experiment strax före användning.
    2. Menadion bereds som en 10 mm stamlösning i 100% aceton, alikvoteras i mindre volymer (ca 50 mikroliter) och förvaras vid -70 ° C. Förbered XTT / menadion lösning strax före användning, genom att tillsätta 1 ìl av stamlösningen av menadion till ett rör som innehåller 10 ml av upptinade XTT lösningen.
11. Täck plattorna i aluminiumfolie och inkubera i mörker i 2 h vid 37 ° C.
12. Avslöja plattorna. Med hjälp av en flerkanalspipett bort 80 mikroliter av den resulterande färgade supernatanten från varje brunn och överför till motsvarande brunnar på en ny mikrotiterplattan.
13. Läs plattan (-er) i en mikrotiterplatta läsare vid 490 nm.
14. Beräkna fastsittande minsta hämmande koncentration SMIC50 och SMIC80, som är svampdödande koncentrationer vid vilka en 50% eller 80% minskning av kolorimetriska avläsningar upptäcks i jämförelse med kontrollgruppen biofilm som bildas i frånvaro av svampdödande läkemedel (i detta fall värden för kolumn 11 , minns också att subtrahera värden från negativa kontroller från brunnar i kolumn 12 innehåller XTT bara). SMIC resultat kan presenteras som en tabell (dvs flera isolerar mot flera fungicider) eller alternativt kan resultaten för varje enskild svamp isolerar mot varandra svampdödande presenteras som en graf genom att markera procent hämning mot svampdödande koncentration.

Exempel: Efter avdrag värdena i den negativa kontrollen är den genomsnittliga OD av kontroll biofilm som bildas i kolumn 11 1,32. Det SMIC50 är den lägsta svampdödande koncentrationen leder till> 50% minskning av kolorimetriska avläsningar, i detta fall mindre än 1,32 x 50/100 = 0,66. Likaså är SMIC80 den lägsta svampdödande koncentrationen leder till> 80% reduktion av kolorimetriska avläsningar, i detta fall mindre än 1,32 x 20/100 = 0,264.

4. Representativa resultat

Figur 1 visar en microphotograph av ett C. albicans biofilm som bildas på botten av en brunn i en 96 väl mikrotiterplatta tagit med ett inverterat mikroskop. Figur 2 visar XTT-kolorimetriska avläsningar (OD ₄₉₀ värden) för varje 11 biofilmer på en C. albicans vildtyp stam som bildas i varje av de 8 olika rader i samma 96 väl mikrotiterplattan. Figur 3 visar aktiviteten av amfotericin B vid olika koncentrationer mot C. albicans biofilmer, pilar anger SMIC50 och SMIC80 värden.

Figur 1. (A) Panel A visar en microphotograph tagits med en kamera som sitter på ett inverterat mikroskop av ett C. albicans biofilm bildas på botten av brunnen efter strävan RPMI medium och därefter tvättar med PBS. (B) Ett mikroskop av en typisk C. albicans biofilm visualiseras med hjälp av svepelektronmikroskop. Bars är 100 ìm och 10 mikrometer för paneler A och B respektive.

Figur 2. Bildandet av flera likvärdiga C. albicans biofilm i 96-håls mikrotiterplattor. Kolorimetrisk mätningar (OD ₄₉₀ värden) från XTT minska analyser av biofilmer som bildas av ett C. albicans vildtyp i brunnar mikrotiterplattor. Värden för 11 oberoende biofilm som bildas i var och en av 8 olika rader i samma 96 väl mikrotiterplattan. Resultat för de olika raderna jämfördes med en-vägs variansanalys och använda Bartlett-test för homogenitet av avvikelser och Bonferroni är multipeljämförelse efter provet. Inga statistiskt signifikanta skillnader noterades när man jämför alla par rader till varandra (P> 0,05).

Figur 3. Typiska resultat av antimykotisk resistensbestämning mot C. albicans biofilmer. Diagram som visar typiska resultat av effekten av olika amfotericin B koncentrationer mot biofilmer av ett C. albicans vilda stammen. Värden uttrycks som genomsnittligt procent kolorimetriska avläsningar för XTT minska analyser jämfört med kontroll brunnar. SMIC50 och SMIC80 värden anges med pilar.

Discussion

Här beskriver vi en enkel, snabb, ekonomiskt och mycket reproducerbar 96 bra modell mikrotiterplatta för bildandet av Candida biofilmer tillsammans med en kolorimetrisk metod som mäter den metaboliska aktiviteter av celler i biofilmen med XTT. Denna 96 väl mikrotiterplatta modell för biofilm bildning utvecklades ursprungligen för C. albicans men kan användas för andra Candida spp.. och lätt anpassas för andra svamp organismer. Metoden kan användas för att undersöka flera olika parametrar och faktorer som påverkar biofilm formation och att uppskatta biofilm-bildande förmåga flera svamp-isolat och / eller muterade stammar. Men kanske viktigast av allt, är denna metod mycket användbar för bestämning av svampdödande resistensbestämning av celler i biofilmer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud-dextrose agar	BD Biosciences	211584	To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose	US Biological	Y2076	Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine	Cellgro	50-020-PB	Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Buffer for washes
XTT sodium salt	Sigma-Aldrich	X4251	See above for preparation instructions
Ringer’s lactate	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	For preparation of XTT solution
Menadione	Sigma-Aldrich	M5625	Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12
15 ml conical centrifuge tubes	Corning	430790
50 ml conical centrifuge tubes	Corning	430828
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated	Corning	3595
Multichannel pipette and tips	Eppendorf
Incubator	Any Supplier
Microtiter plate reader	Any Supplier