Summary
여기 우리는 즉시 정화하여 intraperitoneal 접종 다음과 찬란 다음 주사 사이트에서 자신의 이해와 움직임을 모니터링하고 이러한 이벤트를 중재 전지 특성화 감염 두뇌 자료에서 집계 프리온 봉 라벨 면역 세포 프리온 이해와 인신 매매를 감시를위한 소설 분석을 설명합니다.
Abstract
비정상적인 형태의 존재 프로 테아제, 모성 pathologic 및 전염성있는 호스트 인코딩된 프리온 단백질 (PrPC)는 같은 양의 cervids과 scrapie의 만성 낭비 질병 (CWD)와 같은 프리온 질병을 특징. 프리온 가설이 비정상 conformer가 대부분 또는 모든 감염성 프리온의를 종속 주장한다. 주변 프리온 pathogenesis 초기 행사에 면역 체계의 역할은 설득 CWD과 scrapie 1-3에 대한 증명되었습니다. 생쥐에 유전자 변형과 pharmacologic 연구는 감염 4-6 후 조기 prions을 유지하고 복제의 보완 시스템의 중요한 역할을 공개했다. 또한 70-10 돌기 세포 프리온 보존을 살펴 봤으니, 체외에서와 생체내 연구에서 매매에서 역할이 남아 있지만, 11-16 불분명. Macrophages는 마찬가지로 초기 프리온 pathogenesis에 연루되어 있지만,이 연구는 감염 후 3,11,17 주 발생하는 이벤트에 초점을 맞추고있다. 이러한 이전 연구는 또한 내생 PrP C와 전염성 prions 간의 차별의 문제에서 고통. 여기 우리가 모집 면역 세포에 의해 접종 사이트에서 프리온 이해와 인신 매매를 평가하기위한 semiquantitative, 편견 방식을 설명합니다. 집계 프리온 막대가 아닌 집계 단백질과 자당의 쿠션을 통해 ultracentrifugation의 세제 solubilization에 감염된 뇌 homogenate에서 정화했다. Polyacrylamide 젤 전기 영동, 쿠매시 푸른 얼룩과 pelleted 분수에 매우 풍부한 프리온 봉의 서쪽 모래 바닥 확인 회복. 프리온 막대는 마우스로 fluorochrome - 라벨이 다음 주입 intraperitoneally했다. 2 시간 후에 복막 세척 유체, 비장 및 mediastinal 및 mesenteric 림프절의 면역 세포는 프리온 막대기 유지 및 monocytes, neutrophils, 돌기 세포, macrophages 및 B 및 T 세포에 대한 마커를 사용하여 여러 가지 빛깔의의 유동세포계측법으로 식별 셀 집합에 대한 assayed했다. 이 분석은 감염 후 시간 이내에 면역 획득 세포와 생체내의 인신 매매 prions의 처음으로 직접 모니터링을 허용합니다. 이 분석은 또한 분명 어렵고 다른 분석 시스템의 데이터 해석에 문제가 발생할 수있는 일반적으로 호스트 세포에 표현 PrPC에서 전염성, 집계 prions를 차별화합니다. 이 프로토콜은 다른 접종 경로 (경구, 정맥, intranervous 및 피하 예)와뿐만 아니라 항원 (복합 비즈, 세균 바이러스 및 기생 병원균과 단백질, 계란)에 적용할 수 있습니다.
Protocol
1. 프리온 봉 정화 및 라벨링
이 프로토콜은 한 이전에 출판 18 적응됩니다
- 상업 믹서의 최대 속도로 1 분 후, 얼음에 2 분 얼음 추위 homogenizing 버퍼의 900 ML에서 프리온에 감염된 뇌 조직 100g (HB, 1X PBS 320 MM의 자당, 150 MM NaCl 및 4mm짜리 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 포함하는)를 균질. 세 번 반복합니다.
- 10 3,000 XG에서 분 및 4 ° C.에 대한 homogenate 원심 분리기 제거하고 얼음에 뜨는 저장합니다. 1L HB의 펠렛을 다시 정지 및 단계 1.1과 1.2를 반복합니다.
- 100,000 XG, 0 ° C. 60 분 풀 supernatants 및 원심 분리기 뜨는 폐기하십시오.
- 다시 중지 1X 트리스의 100 ML의 펠렛은 (10 MM 트리스 - HCL, 0.1 MM NaCl 1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))이 2퍼센트 트리톤 X - 100 (TBST)이있는 염분 버퍼. 견적 단백질 브래드 또는 이와 유사한 분석하여 농도 5 TBST에 MG / ML을 조절할 수 있습니다. 30 분 얼음 칠.
- 100,000 XG, 0 ° C.에서 30 분 원심 분리기 뜨는 취소 50 ML의 TBST 다음 100 ML TBS와 펠렛을 씻으십시오. 100 ML 1X PBS 1 %의 sarcosyl 및 테아제 억제제 칵테일을 포함에서 펠렛을 다시 정지 37에서 120 분 저어 ° C.
- 100,000 XG, 10 ° C. 60 분 320 MM의 자당과 원심 분리기 900 ML에 레이어 샘플 뜨는 취소 10 ML 2.3M NaCl에 다시 중지 펠렛, 5 % sarcosyl.
- 얼음 1 분 간격으로 70 % 최대 전력에서 샘플 5 X 40 초 Sonicate.
- 13,000 XG, 4oC에서 15 분 동안 eppendorf 튜브 및 원심 분리기에 샘플 나누어지는 1 ML. TBS 및 매장과 함께 두 번 알약을 씻어 @ -70 ° C 또는 단계 1.9에서 fluorochrome에 공액.
- DyLight 649 1 병을 사용하여 프리온 봉 정화의 공액 한 튜브 제조 업체의 프로토콜에 따라 fluorochrome.
- 필터 컬럼을 통해 투석이나 원심 분리하여 PBS에 대한 Exchange DyLight 라벨 버퍼. -70 ° C에서 멀리 사용할까지 빛으로부터 20 μL aliquots에 보관하십시오.
2. 프리온 접종 및 셀 복구
이 섹션은 intraperitoneal 프리온 접종과 복막, mediastinal 및 mesenteric 림프절과 비장에서 세포의 복구를 포함.
- 사용하는 즉시 이전 형광 프리온 막대 PBS에서 1시 50분을 희석. 엄지와 검지로 지느러미 목 모피로 아저씨의 마우스는 부드럽게 얼굴과 분홍색 손가락으로 꼬리를 묶어 두려고 마우스를 켜십시오. 머리 위에서 뒷다리 몸통 이팅 및 약간 거꾸로 그를 잡고 마우스를 Supinate.
- 30G의 인슐린 주사기를 사용하여 sacroiliac 관절에 앞쪽에 정중선과 1~2cm의 1cm 측면 형광 프리온 막대 100 μL를 주입. 피부를 통해서도 1cm가 medially 45 °를 감독 바늘을 삽입합니다. 컨트롤로 형광 구슬 또는 PBS 혼자의 1시 50분 희석을 사용합니다. 분석하기 전에 할당된 시간 쥐를 품어.
- 승인 동물 보호에 따라 마우스를 안락사 및위원회 프로토콜을 사용합니다. 12 ML 주사기와 25G 바늘을 사용하여 복막 구멍에 PBS 10 ML을 주사. 부드럽게 일분 길이 방향 시체를 바위. 지육 절개가 지속하는 동안 얼음에 15 ML 원뿔 관과 보유에 동일한 주사기와 16G 바늘을 사용하는 복막의 세포 현탁액을 복구합니다.
- 70 % 에탄올로 철저하게 시체의 복부 측면 젖었어. 그냥 집게로 ribcage 아래의 정중선에서 피부를 허용하고 가위로 피부를 통해 작은 절개를 잘라. 각 엔드에서 정중선에서 두 2 cm의 incisions 옆으로 후, 머리와 꼬리 양쪽 방향에서 피부를 통해 3~5cm 긴 절개를, 거기서부터. 다시 필과 복막 및 흉부 충치를 나타내기 위해 피부를 핀. 조심스럽게 복막을 둘러싸고있는 얇은 반투명 세포막을 통해 잘라 폐종격부을 나타내기 위해 흉부를 반영합니다.
- 기관의 복부 쪽 근처 brachiocephalic 동맥 medially 인접한 thymus에 약간 지느러미와 옆으로 인접 2-4 mediastinal 림프절을,,, 찾기 및 제거합니다. 찾기 및 부드러운 흰색 mesenteric 조직에 포함된 여섯 mesenteric의 림프절까지 제거하는 사후 복부 벽에 앵커는 내장. 비장, 단지 정중선의 측면과 복부의 왼쪽에있는 내장에있는 등 지느러미 긴 어두운 빨간색 기관을 찾아 제거합니다. 예약 림프절 얼음 1 ML RPMI 1640 배지에 절개가 완료될 때까지.
- 더운 물에 담가서 부드럽게하고 1 ML 주사기의 플런저를 사용하여 플라스틱 페트리 접시에 RPMI 3 ML로 40 μm의 메쉬 스트레이너를 통해 림프절을 누르십시오. RPMI의 추가 2 ML와 스트레이너를 씻어 15 ML 원뿔 관에 5 ML 세포 현탁액을 전송할 수 있습니다. RPMI의 추가 5 ML있는 페트리 접시를 씻어 같은 튜브로 전송할 수 있습니다. 250 XG에서 5 분 원심 분리기, 1 ML 외과 버퍼 (1X PBS, 1 % 소 혈청 알부민 및 10 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산))에 뜨는을 다시 중단 세포 펠렛을 버리고 1.5 ML Eppendorf 튜브에 전송할 수 있습니다.
다음은 잘 특징인 면역 세포 표면 마커에 대한 형광 항체를 사용하여 면역 세포 하위 집합을 식별에 대한 일반적인 얼룩 프로토콜입니다. 모든 항체는 사용하기 전에 즉시 외과의 버퍼로 희석되었다.
- Eppendorf 튜브에 세포 나누어지는 10 6 세포를 계산합니다. 원심 분리기 세포 (2.7 참조) 1 ML 외과 버퍼로 세척 펠릿 2X.
- 내생 FC 수용체를 차단 2 NG / ML 쥐 방지 마우스 CD16/32 100 μL의 세포에게 얼음에 20 분 알을 품다. 펠렛 및 외과 버퍼로 세척 세포.
- 한 시간 만이라도 얼음의 각 샘플과 부화 1ng / ML 적절한 형광등 antibod (Y) 이거야 100 μL를 추가합니다. 제어 세포에 혼자 외과 버퍼 100 μL를 추가합니다. 펠렛 및 외과 버퍼로 두 번 세척 세포.
- 1 ML ACK 버퍼 (NH 4 Club 호텔 150 MM, 1 MM KHCO 3 0.1 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)) 적혈구를 lyse 1 분 얼음에 품어에서 다시 중지 세포. 펠렛 및 외과 버퍼로 세척 세포. 1 ML 외과 버퍼의 세포를 다시 일시 중지합니다.
- 일반적으로 405, 488 및 633 나노미터 여기 레이저 5-10 형광 방출 탐지기로, 여러 가지 빛깔의 검출 및 분석을 수있는 흐름 cytometer를 사용하여 세포에서 데이터를 수집합니다.
4. 대표 결과 :
우리는 원유에서 프리온 봉 정화, E2 엘크 뇌 homogenate (차선 1 및 2)의 프리온에 감염된 뇌 homogenate (그림 1) 세제 solubilization 및 ultracentrifugation 크게 또한 프로 테아제 K되었습니다 프리온 막대 (차선 1 3 비교)에 대한 풍부한 저항 (레인 4). 흥미롭게도, 소화되지 않은 정화 프리온 막대는 prions에 대한 극적인 농축을 나타내는 소화 E2 뇌 homogenate에 놀랍도록 닮아 glycoform 프로필을 표시합니다. 동일 - 대우 정상 뇌 homogenate는 PK 방지 PrP C를 (차선 5 6) 생산하지 않습니다.
특정 세포 집단의 흐름 cytometric 분석은 항원 두 시간에 의해 복막에 세포를 집으로 발표하고 형광 구슬과 프리온 막대로 PBS 주입 제어를 통해 극적으로 증가 형광 (그림 2)에 의해 입증을 유지 보여줍니다. 동안 구슬 (Figs. 2 시간 - N)에서 세포 프리온 (Figs. 2O - U) - 주사 상당한 형광 표시 마우스 (Figs. 2A - G) 배경 위에 형광 표시 PBS - 취급 컨트롤의 복막에서 수확 대한 세포도 특히 monocytes에 (Figs. 2I와 P), 돌기 세포 (Figs. 2K 및 R) 및 macrophages (Figs. 2L 및 S), 일부 Neutrophils (그림 2J 및 Q)와 적은 B 세포 (그림 2T). 비드와 프리온 베어링 monocytes, 돌기 세포 및 macrophages도 이시간 접종 (Figs. 2AD 및 AK, AF 및 AM과 AG와, 각각), 동안 거의 또는 전혀 PrP CWD 베어링 Neutrophils 후 mediastinal 림프절에서 발견되었습니다 , B 또는 T 세포 (Figs. 2AE와 AL, AH 및 AG 각각 AI와 AP)가 발견되었습니다. 우리는 비장이나 림프절 mesenteric (데이터가 표시되지 않음)에 구슬이나 프리온 막대를 감지하지 않습니다. 토토, 이러한 데이터는 면역 세포의 트래픽이 다른 미립자 항원 매우 비슷하게 prions 것을 보여줍니다.
| 시약 | FLUOROCHROME | 여기 레이저 (NM) | PEAK 방출 (NM) |
| 프리온 막대 | DyLight 649 | 633 | 674 |
| 1 μm의 구슬 | AlexaFluor 660 | 633 | 685 |
| 항체 | |||
| CD11b | eFluor 450 | 405 | 450 |
| Phycoerythrin - Cy7 | 488 | 760 | |
| CD11c | R - Phycoerythrin | 488 | 575 |
| Phycoerythrin - Cy7 | 488 | 760 | |
| Ly6C | Fluoroisothiocyante | 488 | 518 |
| Ly6G | R - Phycoerythrin | 488 | 575 |
| CD21 | DyLight 488 | 488 | 518 |
| B220 | Allophycocyanin - Cy7 | 633 | 785 |
| 인 경우에는 3 번 CD에 들어 | R - Phycoerythrin | 488 | 575 |
그림 1. 감염된 뇌 homogenate에서 프리온 막대의 정제가. 우리는 집계 프리온 봉 (차선 3, 4) 투석을하는 자료를 시작으로 CWD에 감염된 사슴 (E2, 차선 1and 2)에서 10 % 원유의 뇌 homogenate를 사용했습니다. 정상적인 두뇌 homogenate이 (차선 5 6)하지 않는 반면, - 원유 및 정화 재료는 모두 프로 테아제 K 치료 (4 차선 1) 특성 저항을 보여주었다. 분자량 마커는 얼룩의 왼쪽에 KD에 표시됩니다. BH, 뇌 homogenate.
그림 2. 접종은. (패널 AG와 V - AB), 형광 구슬 (HN 및 AC - AI) 또는 프리온 막대는 (OU와 AJ - AP = 연합 뉴스) PBS되었습니다 두 시간 후에 복막에서 mediastinal 림프절에 면역 세포의 인신 매매 prions의 흐름 cytometric 분석 복막 세척 유체 (AU) 또는 두 시간 후에 mediastinal 림프절 (V - AP)에서 수확 마우스 및 세포의 복막으로 주입. PBS (패널 A와 V), 형광 구슬 (패널 H와 AC)과 프리온 막대 (패널 O 및 AJ) 대우 생쥐에서 첫 번째 칼럼보기 세포의 그래프로 보여줍니다. 형광 셀 (빨간색 또는 녹색 점들)와 전체 세포 (회색 점) 상대 크기 (앞으로 분산형), 입도 (사이드 분산형) 및 형광 총 라이브 세포의 비율을 보여주 꾸몄다 있습니다. granulocytes의 특징 세포의 중요한 숫자는 형광 구슬과 막대를 유지. 세포는 또한 면역 세포 표면 마커와 LyG - Ly6C + monocytes에 대한 문이 (패널 B, I, P, W, 광고 및 AK), Ly6c - CD11c - CD11b + Ly6G + neutrophils (C, J, Q, X, AE에 대한 항체 물들일되었습니다 그리고 AL), Ly6G - Ly6C - CD11b + CD11c + 돌기 세포 (D, K, R, Y, AF와 AM), Ly6G - Ly6C - CD11c - CD11b + macrophages, (E, L, S, Z, AG와) 인 경우에는 3 번 CD에 들어 - B220 + CD21 + B - 세포 (F, M, T, AA, AH 및 AO) 및 CD21 - B220 - 인 경우에는 3 번 CD + T 세포 (G, N, U, AB, AI 및 AP). Monocytes, 돌기 세포 및 macrophages은 복막 캐비티 (패널 I와 P, K와 R과 L과 S, 각각)에서 형광 구슬과 프리온 봉을 보유하고 mediastinal 림프절 (패널 광고 및 AK, AF 및 오전 및 AG에게 운반 각각),이 두 입자의 유사한 이해와 인신 매매를 시연. Neutrophils은 구슬 (J)와 적은 봉 (Q)의 상당한 금액을 유지하지만, (AE 및 AL) 림프절에게 전달하지 못했습니다. B 세포 일부 봉 (T 및 AO)하지만 거의없이 구슬을 (M 및 AH) 유지 및 수송. T 세포는 구슬이나 막대 (N, U, AI 및 AP = 연합 뉴스)도없는 인신 매매.
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Discussion
여기 우리는 크게 말초 프리온 감염 초기에 이벤트를 모니터링 용이 생체내에 태그 및 추적 prions에 대한 프로토콜을 보여줍니다. 이 프로토콜은 크게 unambiguously 내생 PrP C에서 차별화에 사전 라벨 매우 풍부한 프리온 inoculum에 의해 체외 9 및 생체내 3,12의 모니터링 프리온 이해에서 과거 시도를 향상시킵니다. 전염성 prions와 PrP C가 동일한 기본 아미노산 서열을 공유하기 때문에 발생 프리온 특정 항체가 문제가되었습니다. 우리는 PK - 소화와 메탄올 우리가 Dylight 649 - labelelled 방지 PrP 항체를 (우리되지 않은 데이터)를 사용하여 추적되는 원유 뇌 homogenate를 시켰던로 주입 PrP의 NULL 마우스를 사용하여 유사한 실험을 수행했습니다. 여기 같이이 실험은 거의 동일한 결과를 생산하지만, PrP NULL 마우스는 프리온 질환 19 감염될 상용는 안되며 알려진 유일한 타고난 프리온 수용체, PrP C 부족합니다. 이 프로토콜은 PrP의 NULL 마우스를 사용하여 잠재적인 문제를 obviating, 내생 PrP C를 표현하는 일반적인 실험실 마우스 종자의 사용을 허용합니다.
B 세포가 밀매 전 모르지만 후자와 같이 확인했지만 여기에 표시된 데이터는 비슷하게되는 면역 세포를 캡처 및 트래픽 prions과 형광 구슬을 나타냅니다. 이것은 프리온 상 6과 같은 이전의 연구 연루 B 세포를 보강 해주. 그러나, 우리의 고도로 농축 프리온 준비는 가능성이 추가로 표시된 단백질 분 수량을 포함, 그래서 우리는 면역 세포의 트래픽이 단백질도 가능성을 배제할 수 없습니다. 단백질 오염에 매우 소량의 프리온 거래 내용을 변경하거나 진정한 생물 학적 시나리오가 결정 남아 모방 여부를 지정합니다.
면역 세포의 거래 두 가지 입자의 성공적인 모니터링 추가이 프로토콜은 이러한 기생충, 박테리아, 바이러스 단백질로 지정하여 추적할 수 있습니다 항원의 다양한 적응 수 있습니다 제안합니다.
비율은 지속적인 유지로이 프로토콜의 ultracentrifugation 단계를 수행하면 큰 샘플 볼륨이있는 한 편리 원심 분리에 대한 작은 것들을 aliquoted 수 있습니다. 예를 들어, 대신 겹겹이 900 ML의 자당 이상의 샘플의 100 ML 한 후 별도의 튜브 90 ML 이상의 계층 10 ML, 원심 분리기 수 있습니다.
예방 접종 기간 동안 뒤로 마우스를 이팅하는 것은 그들에게 실수로 바늘 부상을 최소화 anteriorly 복막 장기 이동합니다. 쥐를 inoculating이 섬세한 막을 rupturing 피하기 위해 복막에서 PBS를 주입하고 aspirating 때 천천히 그리고 조심스럽게 바늘을 삽입합니다.
쥐를 해부하면, 절단 혈관과 림프절 식별 및 검색을 방해할 수있는 기관을 피하기 위해, 손상 복막 및 폐종격부을 덮고있는 얇은 막 떠나, 오직 초기 incisions의 피부를 단칼에 베어하는데주의를 기울여야.
림프절은 종종 지방 조직처럼 보이는, 초기에 식별하기 어려울 수 있습니다. 림프절은 거의 크림색으로 오프 화이트, 원형 및 지방 조직보다 더 firmer 나타납니다. 이러한 연습들과 자신을 동일시하기 훨씬 쉽게된다. 적어도 두 생쥐에서 풀 임파선이 흐름 cytometric 분석을위한 충분한 세포를 복구할 수 있습니다.
후자 실험 설계가 여러 종 그리고 많은 추가적인 컨트롤 샘플에서 생성된 항체주의 선택이 필요로 동시에 여러 세포 표면 마커를 식별을 위해, 우리는 강하게, 감지를위한 보조 형광 방지 isotype 항체를 필요로 레이블이 지정되지 않은 항체를 통해 형광 항체를 사용하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 마우스 처리와 관련하여 도움이 ultracentrifugation와 패티 키서와 관련하여 도움이 스티브 McBryant와 제프 핸슨 감사드립니다. 국립 보건원의 신경 질환 및 뇌졸중의 국립 연구소, 부여 5R01NS056379 - 02이 작품을 후원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CWD-infected elk brain | Private elk farm in Colorado | Use any non-human prion-infected brain | |
| Blender | Oster Professional Products | 6694-015 | Use any commercial blender |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | SS34 rotor | Use any centrifuge /rotor that can reach 3000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | 50.2 Ti rotor | Use any ultracentrifuge /rotor that can reach 100,000 x g and hold ≥ 500 ml volumes |
| Bradford Reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Complete mini protease inhibitor cocktail | Roche Group | 11 836 170 001 | |
| Sonicator | Misonix | MP4000X | Use any horn or probe sonicator set to ~70% max power |
| DyLight antibody Labeling kit | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 53050 | |
| microcentrifuge | Eppendorf | 55430R | Use any refrigerated microcentrifuge that can achieve 13,000x g |
| centrifugal filter columns | EMD Millipore | Microcon YM-100 | Use any filter or dialysis membrane with 100 Kd molecular weight cutoff |
| 8-40 week-old FVB mice | Charles River Laboratories | 207 | Use any inbred mouse strain |
| 1 μm red fluorescent beads | Phosphorex | 2307 | Use any fluorescent bead ≤ 10 μm |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon BD | 352340 | |
| fluorescent antibodies | BD Biosciences | Various | Use any fluorescent antibody appropriate for your application. |
| flow cytometer | Dako | CyanADP | Use any flow cytometer capable of multicolor fluorescence detection |
References
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