Avslag på Fluorescens Bakgrund i resonans och spontana Raman microspectroscopy

Summary

Vi diskuterar byggande och drift av ett komplext ickelinjära optiska system som använder ultrasnabb heloptisk byter till isolera Raman från fluorescens signaler. Med detta system har vi möjlighet att lyckas skilja Raman och fluorescens signaler utnyttja puls energi och genomsnittlig krafter som finns kvar biologiskt säkra.

Abstract

Ramanspektroskopi är ofta plågas av en stark fluorescerande bakgrund, särskilt för biologiska prover. Om ett prov är glada med ett tåg av ultrasnabba pulser, ett system som tidsmässigt kan separera spektralt överlappande signaler på en pikosekund tid kan isolera snabbt ankommande Raman spritt ljus från sen ankomst fluorescens ljus. Här diskuterar vi byggande och drift av ett komplext ickelinjära optiska system som använder all-optisk koppling i form av en låg effekt optisk Kerr grind för att isolera Raman och fluorescens signaler. En enda 808 nm laser med 2,4 W i medeleffekt och 80 MHz repetitionsfrekvens är delad, med cirka 200 MW 808 nm ljus omvandlas till <5 MW 404 nm ljus som skickas till provet för att excitera Ramanspridning. Resterande oomvända 808 nm ljus skickas sedan till ett ickelinjärt medium där det fungerar som pumpen för alla optiska slutare. Slutaren öppnas och stängs i 800 FS med en maximal effektivitet på ca 5%. Med detta system har vi möjlighet att lyckas skilja Raman och fluorescens signaler på en 80 MHz repetitionsfrekvens med puls energi och genomsnittlig krafter som finns kvar biologiskt säkra. Eftersom systemet inte har någon ledig kapacitet i form av optisk effekt, vi detalj flera design och anpassning överväganden som stöd i att maximera genomströmningen av systemet. Vi diskuterar också våra protokoll för att erhålla den rumsliga och tidsmässiga överlappning av signalen och balkar pump inom Kerr medium, samt en detaljerad protokoll för spektrala förvärvet. Slutligen redovisar vi några representativa resultaten av Raman spektra som erhålls i närvaro av en stark fluorescens med hjälp av vår tid-slussning systemet.

Protocol

1. Vissa försiktighet måste vidtas för att förbereda och placera en Raman prov inom detta system.

1. Eftersom systemet vanligtvis använder sig av mycket hög numerisk apertur mål med mycket korta arbetsavstånd, är proverna placeras på ett täckglas. Biologiska prover placeras normalt på en Nr 1 tjocklek täckglas monterat i en Attofluor cell kammare (Invitrogen, Carlsbad, CA).
2. Flytande prover, särskilt de giftiga för människor, är placerade i en liten glasflaska med ett täckglas cementeras till öppningen med hjälp av en silikon epoxi. Flaskan är sedan inverteras för mätning.
3. Eftersom vårt system beror på exakt timing av pumpen och pulser signalen, vi är begränsade att inte använda konventionella fokus justering av vårt mikroskop, som översätter målet upp och ner. Detta lägger till och drar ifrån optisk väg från vårt system. Istället placerar vi våra prover på en sekundär scenen monterad på toppen av mikroskop scenen som har sin egen oberoende fokusstyrning.

2. För att ta time-gated Raman spektra, måste excitation balken vara ordentligt förberedd.

1. Vi börjar med lätta väg ut ur en 2,4 W avstämbara pulsade Ti: Sapph laser (Chameleon, sammanhängande system, Santa Clara, CA). Varje puls i 80 MHz pulståget har 30 nj av energi, har en temporal bredd på 140 fs och har ett spektrum centrerad vid 808 nm med en spektral bandbredd ~ 6 nm.
2. För att förhindra back-reflexer från att åter komma lasern hålighet är ljuset passera genom en Faraday isolator. En halv-våg plattan placeras före Faraday isolator möjliggör kontinuerlig avstämning av den totala effekten som skickas in i systemet.
3. Eftersom 6 nm är för bred en bandbredd för att lösa de flesta Raman lägen, är balken skickas via en mycket smal (0,8 nm FWHM, Andover Corporation, Salem, NH) bandpassfilter centrerat på 808 nm.
4. Ljuset är så fokuserad genom en akromatisk doublet (f = 100 mm) på en 5 mm β-Barium Borat (BBO) kristall (CASIX, Fuzhou, Fujian, Kina) att halvera våglängden från 808 nm till 404 nm. Den BBO kristall är placerad i ett fäste med spets och tilt kontroller, och även monterad på en översättning scen. För att maximera effektiviteten i våglängd konverteringen måste kristallen placeras exakt symmetrisk om inriktningen av dubbletten, och med dess kristallklara axel anpassas till polarisering av den inkommande strålen.
5. Eftersom effektivitet våglängd konverteringen är polariseringen-beroende, kan kontrollen över den mängd ljus som skickas till provet erhålls genom att placera en andra halv-våg platta efter Faraday isolator. Genom att rotera denna waveplate kan intensiteten av ljus som skickas till urvalet justeras oberoende av intensiteten som skickas i pumpstrålen (diskuteras nedan).
6. Våglängden-konverterade ljus recollimated med en andra akromatisk doublet (f = 500 mm) väljs så att de spännande strålen är tillräckligt stor för att fylla på baksidan öppning mikroskop målet, och riktade in i ett inverterat mikroskop (IX-71, Olympus, Center Valley, PA) med hjälp av två Speglar som kan styra.
7. Mikroskopet målet, är det optiska elementet är inrymt i den mest monolitisk komponenten i systemet, definierar optiska axeln. Att anpassa excitation balken till denna axel, är en spegel placeras i urvalet plan mikroskop. De två Speglar som kan styra sedan iterativt avstämd med iakttagande av back-reflekterade laserstrålen på en CCD CAM-eran (μEye, IDS, Obersulm, Tyskland) bifogas avbildning hamnen i mikroskopet. Förutsatt att bilden på kameran är centrerad på mikroskop s fält-of-view, är balken på-axeln när fokus platsen är centrerad på mikroskopet chip och översättning av målet längs z-axeln ändras inte mittpunkten av defocused balken.
8. När ett prov placeras i provet planet och bestrålas med laserljus Ramanspridning inträffar. En dikroiskt filter placeras under mikroskop mål skiljer våglängd återuppspelat Raman spritt ljus (och fluorescens) från impulspunkten balk, styra Raman spritt ljus åt sidan hamnen i mikroskopet. Mikroskopet ändrades för att ta bort alla linser i denna väg, så att signalen Ljuset kommer från parallellt mikroskop.
9. Eftersom signalen strålen framkommit i mikroskop är större än tydlig öppning Glan-Thompson polarisatorer, en 0.47x teleskop tillverkat av två akromatisk dubletter (f1 = 75 mm, f2 = 35 mm) används för att krympa strålen.
10. Signalen ljuset är då polariserat av en Glan-Thompson polarisator orienterade vid 0 ° i förhållande till vertikalt i labbet ram och riktad till en dikroisk spegel där det är modifierat med pumpen balken.

3. För den optiska porten att fungera med maximal effektivitet, måste försiktighet iakttas vid beredningen av pumpstrålen (Kerr balk) också.

Pumpen pulsen är först förstoras med 0.35x med ett teleskop konstruerat med två akromatisk dubletter (f1 = 35 mm, F2 = 100 mm) för att matcha den slutliga storleken på signalen balken.

Pumpen strålen skickas sedan till en försening linje som består av en rät vinkel prisma placeras på en linjär översättning skede som kan anpassas för att säkerställa tidsmässiga överlappning av pumpen och pulser signalen (tuning diskuteras nedan).

Efter förseningen linje är balken skickas via en halv-våg platta och polarisator orienterade 45 ° i förhållande till vertikalt i labbet ramen. Detta säkerställer korrekt polarisering tillstånd pumpstrålen när den når ickelinjära mediet.

Ljuset reflekteras sedan bort av två Speglar som kan styra, en med piezoelektriska kontroller som används för att finjustera positionen för pumpstrålen så att den överlappar rumsligt med signalen balken. Överlappningen erhålls genom att observera pumpen och balkar signal vid två platser, ett nära och ett långt från dikroiskt spegeln där strålarna kombineras. Genom att använda den första styrningen spegeln för att överlappa de två strålar på nära punkt och piezo spegeln för att överlappa strålar längst punkten kan pumpstrålen göras exakt collinear med signalen balken.

Med de två strålarna kombineras är Kerr porten och insamlingssystem inrättas för att maximera den samlade tiden gated signal.

4. Med de två strålarna kombineras är Kerr porten och insamlingssystem inrättas för att maximera den samlade tiden gated signal.

1. Pumpen och signal balkar är först passera genom en dikroisk filter som har en OD 6 vid 404 nm för att förhindra att eventuella kvarstående excitation ljus från spännande Ramanspridning inom ickelinjära mediet.
2. Pumpen och balkar signal då både fokuserad genom en akromatisk doublet (f = 35 mm) i en 1 cm sträckenhet kvarts kyvett innehåller olinjära material. Varje ickelinjära material med tillräckligt hög olinjär index (högre än CS ₂₎ och lämpligt korta tidsmässiga svar (<2 PS), kan utnyttjas här. För dessa experiment använder vi koldisulfid, CS _2, som har en olinjär index n ₂ = 3,1 x 10 ^-18 m ² / W. Ljuset är då recollimated av en andra doublet med en brännvidd identisk med den första.
3. Balkarna är sedan passerade och Glan-Thompson analysator på en roterande fäste, och sedan genom en uppsättning av absorption och störningar filter som tillsammans har en OD 10 till 808 nm.
4. Slutligen är den signal ljus fokuserad genom en akromatisk doublet (f = 35 mm) till en 50 ìm multimode optisk fiber, där fibern är monterad i en scen som gör att översättning i x, y och z. Fibern är då kopplad till en kommersiell avbildning spektrograf med bifogade CCD-kamera (SP2300i och Pixis 100B,, båda tillverkade av Princeton Instrument, Trenton, NJ).
5. För att anpassa insamlingssystemet för att maximera in-signal, är analysatorn satt till 0 ° och ett prov av toluen är placerad i provet planet. Genom att justera x, y och z kontroller av fiber berget, är den samlade Raman signalen optimeras.
6. För att säkerställa korrekt rumsliga och tidsmässiga överlappning av pumpen och balkar signal, är en spegel placeras i urvalet plan mikroskop. Den 404 nm filtret tas bort från systemet. Med analysatorn vridas till 90 ° är retroreflected 404 nm stråle skickas till spektrografen med den intensitet justeras så att den inte mätta kameran. Med pumpstrålen släckt är analysatorn roteras för att minimera den överförda signalen 404 nm. Med pumpstrålen slås på igen, är förseningen scenen sakta inställd tills överföringen av 404 nm ljuset börjar öka. Sedan, genom iterativ tuning förseningen scenen, piezoelektriska spegel, och x, y och z kontroller av fiber, maximerar en signal.
7. Eftersom retro-reflekterade 404 nm balken och Raman spridda ljuset kan ta lite olika vägar genom systemet, är slutgiltiga justeringar genom att placera en stark Raman scatterer (t.ex. toluen) på provet scenen och den något tweaking anpassning genom att ändra dröjsmål skede piezeo-elektriska spegel, och x, y och z kontroller av fiber för att optimera Raman signalen.

5. Insamling av en enda gång-medierade Ramanspektrum kräver förvärv av flera spektra för att korrigera för system artefakter.

1. Med analysatorn satt till 0 °, excitation balk på och pumpstrålen av, är en "ungated" spektrum vidtas, som representerar spektrum som skulle köpas utan förmånen av tiden-gating systemet.
2. Med analysatorn inställd på 90 °, excitation balken och pumpstrålen fortfarande av, är en bakgrund spektrum tas, vilket motsvarar mängden ströljus läcker igenom polariserarna och andra element i systemet.
3. Med analysatorn resterande 90 °och alla balkar på, "gated" spektrum tas, som representerar den Raman spritt ljus tillåts genom korsade polarisatorer av närvaron av pumpen balken.
4. Slutligen, när analysatorn är fortfarande på 90 °, det excitation stråle av och pumpstrålen på är en annan bakgrund spektrum tas, vilket motsvarar det bidrag till "gated" spektrum av rester av 808 nm ljus kommer in i spektrograf.
5. Dessutom är ett spektrum tas med alla lasrar bort, karaktäriserar baseline "mörka" signalnivå i kameran och elektronik.
6. Eftersom Spectra ofta kräver långa integration gånger är det absolut nödvändigt att bryta denna integration gång i flera bitar (frames) för att möjliggöra ordentlig korrigering av kosmisk strålning - ett vanligt problem vid förvärv av data över spänner över flera minuter.

6. Väl förvärvat flera processteg är till hjälp för att förbättra kvalitet och utseende av data.

1. Först är alla spektra mörka korrigeras genom att subtrahera från den "mörka" spektrum.
2. Att korrigera för kosmisk strålning, är flera ramar utgör ett förvärv i förhållande till varandra på en pixel-för-pixel basis. För varje pixel i varje bildruta som faller utanför 2 median avvikelser från medianvärdet för den pixeln i alla ramar, är att pixel värde ersättas av medianvärdet för samtliga ramar.
3. Den kosmiska ray korrigerade ramar är då medelvärde och jämnas med en Savitzky-Golay filter ^1.
4. Att extrahera den "sanna" gated spektrum, subtrahera vi "excitation-bara" och "pump-bara" spektra från det uppmätta gated spektrumet.
5. Slutligen gated och ungated spektra sedan bakgrunden korrigeras genom att subtrahera en 5: ^e ordningens polynom, fastställd enligt den metod Lieber och Mahadevan-Jansen ^2.

7. Representativa resultat:

Figur 1. Schematisk beskrivning av Kerr gating systemet. Pumpen strålgången visas i rött, medan SHG sökvägen visas i blått. Stigen där Raman och Fluorescens överlappas visas i grönt, medan den sökväg där Fluorescens har temporärt filtreras bort visas i gult. Förkortningar som följer: BPF, bandpassfilter, CCD, chipet, DCM, dikroiskt spegeln, FI, Faraday isolator, λ / 2, halv våg-plattan, LPF, lång-pass filter, NLM, ickelinjära medium; P, polarisationsfilter , SHG, andra harmonic generation kristall.

Figur 2 Överst:. Raw spektra av kumarin löst i immersionsolja. Röd kurva visar spektrum som tas med grinden hålls öppen (analysator inställd på maximal transmission). Svart kurva visar spektrum som tas med analysatorn anpassad för minimal överföring och en pumpstrålen tillämpas (gated spektrum). Blå kurvan visar spectum tas med analysatorn anpassad för minimal överföring och ingen pump balk tillämpas (grinden hålls stängd). Grön kurva visar spektrum tas med endast pumpstrålen tillämpas. Streckade magenta linjer anger spektrala regionen visas i faktarutan nedan. Alla Spectra har jämnats med en 11 punkt, 3: e ordningens Savitzky-Golay filter. Nederst: Spectra av kumarin löst i immersionsolja efter fluorescens bakgrund subtraktion. Röd kurva är spektrum med grinden hålls öppen, och den blå kurvan är gated spektrumet. Den gated spektrum visar tydligt invecklade hög wavenumber topp karakteristisk för oljor.

Discussion

Området biomedicinska Raman-spektroskopi har sett ökande intresse under de senaste åren som ett resultat av dess visat potential för att lösa flera svåra utmaningar i biologiska diagnostik. Till exempel har Raman spektra visat sig ha diagnostiskt värde i cancer upptäckt ^{3, 4, 5, 6.} Raman-spektroskopi har också använts i bakterie kvantifiering ^{7, 8} och bakteriella läkemedel svar ^9. Den har också funnit tillämpning i ett brett spektrum av andra biomedicinska tillämpningar som sträcker sig från benhälsa ¹⁰ till biofluid analys ^{11, 12.}

Trots sådana stor potential har dock Ramanspektroskopi ett stort hinder för över-kommer i de flesta biologiska system: dess extremt svaga tvärsnitt. Därför kan Raman signaler lätt överväldigas av ännu ganska blygsam fluorescerande bakgrunder. Många tekniker finns för att ta bort fluorescens lineshape ^{2, 13, 14.} Men ingen av dessa tekniker adressen verkligen den viktigaste frågan med starkt fluorescerande bakgrunder, skottet brus bidrog till spektrum av närvaron av det fluorescerande bakgrunden överväldigar Raman-signalen och kan inte dras bort. Flera tekniker, såsom konsekvent anti-Stokes Raman-spektroskopi (bilar) och stimulerad Ramanspridning (eller omvänt Ramanspridning), har utvecklats för att försöka förstärka styrkan av Raman signalen ^{15, 16, 17.} Men alla dessa tekniker är i första hand gäller för transparenta prover och har sina egna bakgrunder och problem med kemisk känslighet ^18.

Skärmning detektorn från fluorescenssignalen är det enda sättet att verkligen avvisa skottet buller i samband med fluorescens bakgrund i spontana Ramanspridning. Över ett decennium sedan, Matoušek et al. visat fluorescens avslag med en ultrasnabb Kerr slutartid för att temporärt isolera Raman och fluorescens signaler ^{19, 20.} Men hittills har detta system inte funnit bred användning inom det biologiska området på grund av behovet för alltför hög puls energier. Systemet presenteras i detta meddelande, däremot, använder 1000 gånger svagare puls energier än vissa tidigare rapporter och är kompatibel med biologiska system.

Vårt system, som visas i figur 1 använder en collinear Kerr grind geometri för att spara energi och ge så mycket överlappning mellan pumpen och bjälkar signal i den ickelinjära mediet som möjligt. Dessutom tar vi hand för att minska optiska förluster så mycket som möjligt för att säkerställa att vi har den högsta tillgängliga kraften att driva våra Kerr slutare. Med hjälp av detta system som vi har fått Raman spektra av mycket fluorescerande biologiska prover, nämligen Jasmine anläggning stam, utan observation av någon fotoskador ^21. I denna rapport visar vi några representativa uppgifter om ett modellsystem av en växt-baserad fluoroforen (kumarin, F som ≈ 5 ns) upplöst i mikroskop immersionsolja. Detta visas i figur 2. I den övre panelen ser vi starka "ungated" spektrum (analysator satt till 0 °) i rött, skalas till 0,04% av sitt högsta värde för visualisering ändamål. Observera att det inte finns några märkbara Raman toppar synliga. Nedan, i svart, är den råa gated spektrum (dvs spektrum med både pump och excitation laser på). Därunder, i blått, är spektrum med bara excitation lasern, vilket motsvarar återstående fluorescens läcker igenom korsade polarisatorer. Slutligen, i grönt, ser vi bakgrunden på grund av pumplaser läcker genom en kombination av absorption och interferens filter placeras i systemet. I den nedre panelen i figur 2 ser vi en subregionen av ungated och gated spektrum (region betecknas med streckade magenta linjer i den övre panelen) efter avdrag för en 5: e ordning polynom. Den gated spektrum visar tydligt den höga wavenumber topp i samband med fett, medan ungated spektrum har ingen tydlig Raman funktioner.

Trots att vårt system inte fungerar med stor effciency närvarande (av Finansinspektionen överföring mätt har varit runt 5%) är absolut signalstyrka vanligtvis mindre viktigt än signal-brus. Det finns flera stora klasser av biologiska prover som mäter konventionella Raman spektra det antingen är svårt eller opraktiskt på grund av överväldigande fluorescens bakgrunder. För dessa prover kan vårt system ge en definitiv signal-brus förbättring, som kan ses tydligt i figur 2.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lenses	Thorlabs Inc.	Various	All lenses coated to have maximum transmission losses of 1% each
Tunable Ti:Sapph laser	Coherent Inc.	Chameleon	30 nJ, 200 fs, 80 MHz
40X oil immersion objective	Olympus Corporation	UApo/340	NA = 1.35
Inverted microscope	Olympus Corporation	IX-71	Modified to remove all lenses in side port
Half wave plate	Thorlabs Inc.	AHWP05M-600
Glan-Thompson polarizer	Thorlabs Inc.	GTH10M	∼10% transmission loss
Spectrometer	Princeton Instruments/Acton	SP2300i
CCD	Princeton Instruments/Acton	Pixis 100B
Mathmatical software	Mathworks	MATLAB	version 2008a
Faraday isolator	EOT	BB8-5I
Piezo-electric mirror	Newport Corp.	AG-M100
BBO crystal	CASIX	custom	1 mm thickness
Bandpass filter 1	Andover	008FC14	808 ± 0.4 nm
Dichroic mirror	Semrock	FF662-FDI01	band edge at 662 nm
Long-pass filter	Semrock	BLP01-405R	band edge at 417 nm
Bandpass filter 2	Semrock	FF02-447/60	417-447 nm
CS2	Sigma-Aldrich	335266	99% purity
Coumarin 30	Sigma-Aldrich	546127	99% purity
Immersion oil	Cargill Labs	16242	Type DF