Summary
Cet article décrit une technique simple pour induire l'anergie alloantigène spécifique dans les cellules mononucléées du sang périphérique. La technique peut être appliquée en clinique pour générer des cellules de donneurs non-alloréactifs. La perfusion de ces cellules pourrait améliorer la reconstitution immunitaire et réduire la toxicité après allogreffe de cellules souches hématopoïétiques.
Abstract
Allogénique de cellules souches hématopoïétiques (AHSCT) offre les meilleures chances de guérison de nombreux patients atteints de maladies congénitales et acquises hématologiques. Malheureusement, la transplantation de cellules T du donneur alloréactifs qui reconnaissent et endommager les tissus sains du patient peut entraîner la réaction du greffon contre l'hôte (GvHD) 1. Un défi pour AHSCT succès est la prévention de la GvHD sans déficience associée aux effets bénéfiques des cellules T du donneur, en particulier la reconstitution immunitaire et la prévention de la rechute. GvHD peuvent être évités par des non-spécifique déplétion des cellules T du donneur de greffes de cellules souches ou par l'administration de l'immunosuppression pharmacologique. Malheureusement, ces infections augmentation des approches et la maladie récidive 2-4. Une autre stratégie consiste à réduire de manière sélective les cellules T du donneur alloréactifs après allostimulation antigène par les cellules présentatrices bénéficiaires (APC) avant la transplantation. Les premiers essais cliniques de ces stratégies allodepletionamélioré la reconstitution immunitaire après greffe de CSH HLA-incompatibles sans excès GvHD 5, 6. Cependant, certaines techniques nécessitent allodepletion spécialisée destinataire APC production 6, 7 et certaines approches peuvent avoir des effets hors-cible, y compris la déplétion des cellules T donateurs pathogènes spécifiques 8 et T CD4 des cellules régulatrices 9. Une approche alternative est l'inactivation des cellules T du donneur alloréactifs via l'induction de l'allo-hyporéactivité spécifique. Ce résultat est obtenu en stimulant les cellules du donneur avec le bénéficiaire APC tout en assurant le blocage de CD28 à médiation signaux de co-stimulation 10. Cette «alloanergization" approche réduit alloréactivité par 1-2 logs tout en préservant pathogènes et des réponses associées à la tumeur d'antigènes de cellules T in vitro 11 . La stratégie a été employée avec succès dans les 2 complété et 1 en cours d'études cliniques pilotes où alloanergized lymphocytes T du donneur ont été perfusés pendant ou après HLA-incompatibles HSCT résultant de reconstitution immunitaire rapidetion, peu d'infections moins sévères et GvHD aiguë et chronique que les bénéficiaires de contrôle historiques de non manipulé HLA-incompatibles transplantation 12. Ici, nous décrivons notre protocole actuel pour la génération de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) qui ont été alloanergized à HLA-incompatibles PBMC stimulateur indépendants. Alloanergization est atteint par allostimulation en présence d'anticorps monoclonaux dirigés contre les ligands B7.1 et B7.1 pour bloquer CD28 médiée par co-stimulation. Cette technique ne nécessite pas la production de l'APC et spécialisée stimulateur est simple à réaliser, ne nécessitant qu'une seule étape et relativement brève incubation ex vivo. En tant que tel, l'approche peut être facilement normalisé pour l'utilisation clinique de générer des cellules T avec des bailleurs de fonds alloréactivité réduite, mais en conservant un agent pathogène spécifique immunité pour le transfert adoptif dans le cadre de AHSCT pour améliorer la reconstitution immunitaire sans GvHD excessive.
Protocol
Discussion
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ficoll-Hypaque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | |
RPMI 1640 | Invitrogen | 11875-093 | |
Hepes 1M | Invitrogen | 15630-080 | |
L-Glutamine 200mM | Invitrogen | 25030-081 | |
Gentamicin | Invitrogen | 15750-060 | |
Human AB serum (heat inactivated) | Gemini Bio Products | 100-512 | Use validated batches |
Complete Culture Media (500ml) | 440ml RPMI 1640, 50ml AB serum, 5ml Hepes, 5 ml Glutamine, 167uL Gentamicin | ||
Irradiator | GammaCell 1000 | ||
T-25 Cell Culture Flasks with gas permeable caps | Corning | 3056 | |
Humanized Monoclonal anti-B7.1 and anti B7.2 antibodies | See protocol text | ||
U bottomed 96 well culture plates | BD Biosciences | 353077 | |
Monoclonal CD3 antibody | Beckman Coulter Inc. | IM0178 | Reconstitute with 200ml distilled water |
Monoclonal CD28 antibody | Beckman Coulter Inc. | IM1376 | Reconstitute with 200ml distilled water |
CMV grade 2 antigen | Microbix | EL-01-02 | |
Tritiated Thymidine | NEN | NET027 | |
Scintillation Fluid | PerkinElmer, Inc. | 1205-440 | |
Harvester | Tomtec | ||
Printed Filtermat A | PerkinElmer, Inc. | 1450-421 | |
Filter Bag | PerkinElmer, Inc. | 1450-432 | |
1450 MicroBeta TriLux Scintillation Counter | Wallac | ||
null |
References
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