Summary
न्यूट में, लेंस परितारिका pigmented उपकला कोशिकाओं (ipes) के transdifferentiation द्वारा पृष्ठीय परितारिका से हमेशा पुन: बनाता है. यहाँ हम पृष्ठीय संस्कृति और उदर न्यूट IPE कोशिकाओं न्यूट आंख और उनके आरोपण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. प्रत्यारोपित कोशिकाओं तो ऊतक सेक्शनिंग और immunohistochemistry द्वारा अध्ययन कर रहे हैं.
Abstract
न्यूट और axolotl तरह Salamanders करने के लिए अपने जैसे अंग, रीढ़ की हड्डी, आंख, मस्तिष्क, हृदय, एक जबड़े के साथ पूंछ खो शरीर के अंगों की कई पुनर्जीवित करने की क्षमता के अधिकारी. विशेष रूप से, newts अपने लेंस पुनर्जनन क्षमता के लिए अद्वितीय हैं. लेंस को हटाने पर, पृष्ठीय परितारिका के IPE कोशिकाओं लेंस कोशिकाओं के transdifferentiate और अंततः के बारे में एक 2,3 महीने में एक नया लेंस के रूप में. उत्थान की इस संपत्ति वेंट्रल परितारिका कोशिकाओं के द्वारा कभी नहीं प्रदर्शित है. आईरिस कोशिकाओं के उत्थान की क्षमता इन विट्रो सुसंस्कृत IPE कोशिकाओं के प्रत्यारोपण बनाने द्वारा अध्ययन किया जा सकता है. संस्कृति के लिए, पृष्ठीय और उदर परितारिका कोशिकाओं आंख को पहले से अलग हैं और 2 सप्ताह (चित्रा 1) के एक समय अवधि के लिए अलग से सुसंस्कृत. ये संवर्धित कोशिकाओं reaggregated और न्यूट आँख को वापस प्रत्यारोपित. पिछले अध्ययनों से पता चला है कि पृष्ठीय reaggregate अपने लेंस बनाने की क्षमता रखता है जबकि वेंट्रल कुल एक लेंस फार्म नहीं करता recapitulating, vivo प्रक्रिया में इस प्रकार (चित्रा 2) 4,5. पृष्ठीय और उदर परितारिका कोशिकाओं की पुनर्जनन क्षमता का निर्धारण करने की यह प्रणाली लेंस उत्थान में शामिल जीन और प्रोटीन की भूमिका का अध्ययन करने में बहुत उपयोगी है.
Protocol
1. आईरिस सेल संस्कृति
- 7 (3 aminobenzoate मीथेन सल्फोनिक पीबीएस में तैयार एसिड एथिल 0.1% में anesthetized) newts और जगह में कैल्शियम, मैग्नीशियम मुक्त हैंक्स समाधान (CMF) से आंखों लीजिए.
- दस्ताने बदलें और टिशू कल्चर हुड में काम करते हैं.
- Lugol's - EtOH में 3 सेकंड के लिए आंख गेंदों जीवाणुरहित.
- सीएमएफ में 2 बार धो लें.
- हैंक्स आँखें स्थानांतरण और विच्छेदन शुरू.
- परितारिका - corneal जटिल टुकड़े करना और तंत्रिका रेटिना हटा दें.
- हैंक्स की एक नई डिश में परिसरों स्थानांतरण.
- पृष्ठीय और उदर आधा में # 15 स्केलपेल, अलग परिसरों का उपयोग करना.
- आईरिस (पहली उदर) टुकड़े और जगह एक डिश में 1 मिलीलीटर एल-15 युक्त निकालें.
- 15% (150 उल) dispase की मात्रा (7.5 इकाइयों / मिलीलीटर एकाग्रता) जोड़ें.
- 27 ° 2 घंटे के लिए सी (parafilm साथ लपेटो पकवान) सेते हैं.
- Stroma (प्लेस पर में 27 trypsin समाधान ° C) से IPE कोशिकाओं को अलग.
- एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब IPE कोशिकाओं में ले लीजिए.
- अपकेंद्रित्र आरटी पर 1000 आरपीएम (कमरे के तापमान) पर 2 मिनट के लिए, सतह पर तैरनेवाला हटा दें.
- आरटी पर 2 मिनट के लिए 1000 rpm पर 1 मिलीलीटर हैंक्स और अपकेंद्रित्र के साथ धो, सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- 2 घंटे के लिए 27 पर सेते डिग्री सेल्सियस, 1 मिलीलीटर trypsin समाधान जोड़ें
- आरटी पर 2 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र, trypsin हटा दें.
- जोड़ें 1 मिलीलीटर L-15 को धोने के लिए, 2 मिनट के लिए 1000 rpm पर अपकेंद्रित्र.
- 800 उल एल-15, pipet धीरे धीरे ऊपर और नीचे ~ 10 बार (12 से अधिक बार पालन कम कर देता है) में जोड़ें.
- प्लेट एक अच्छी तरह से 24 कोलेजन लेपित और 27 पर थाली सेते पर IPE कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस 2 सप्ताह (आमतौर पर, 4 पृष्ठीय और 4 वेंट्रल कुओं 7 newts से प्राप्त कर रहे हैं) के लिए.
- इस स्तर पर कोशिकाओं के जीन अभिकर्मक या कारकों के साथ इलाज के लिए उत्प्रेरण या लेंस के उत्थान के साथ हस्तक्षेप में उनकी भूमिका का निर्धारण के लिए उपयुक्त हैं.
2. परितारिका कक्ष का एकत्रीकरण
- प्लेटों युक्त परितारिका कोशिकाओं 400 μl मध्यम, भंवर धीरे dispase समाधान के 20μl जोड़ने के.
- 27 ° रात भर के लिए सी प्लेटें सेते हैं.
- Pipet धीरे ऊपर और नीचे कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए
- Eppendorf ट्यूब और आरटी में 1000 rpm पर 2 मिनट के लिए स्पिन में प्लेस कोशिकाओं.
- 1 मिलीलीटर पूरा एल 15 जोड़कर मध्यम और धोने निकालें, आरटी में 1000 rpm पर 2 मिनट स्पिन, मध्यम हटायें.
- कुल प्रति 2000-7000 कोशिकाओं का उपयोग करें. प्रत्येक ट्यूब में 200 उल कुल प्रति एल-15 जोड़ें.
- नए Eppendorf ट्यूबों में भाजित कोशिकाओं (200 μl).
- आरटी पर 2 मिनट के लिए 1000 rpm पर स्पिन.
- 27 में 48 बजे के लिए सेते ° सी.
3. Aggregrated कक्ष का आरोपण
- न्यूट आंख की कॉर्निया में एक छेद बनाओ और लेंस को हटा दें.
- लेंस को हटाने के बाद, आंख की ventral पक्ष पर corneal ऊतक के ठीक नीचे IPE सेल कुल जगह है.
- newts एक महीने के लिए रखा जाता है उन्हें लेंस पुनर्जन्म.
4. न्यूट आँखों के एम्बेडिंग
- न्यूट कुल के साथ प्रत्यारोपित आँखों निकालें और यह फॉस्फेट में जगह खारा (पीबीएस) buffered.
- 4 ° C में 4% की paraformaldehyde में कम से कम 4 बजे या रात के लिए ठीक है.
- Pbs, 4 ° C में 30 मिनट के लिए धोएं.
- 4 ° C 30 मिनट: यह 0.85% खारा के साथ समझो.
- 15 मिनट के लिए: आरटी / खारा (1:1) इथेनॉल में धो डालें.
- 70% इथेनॉल में धो: आरटी, 15 मिनट. इसे एक बार दोहराएँ.
- आर टी, 30 प्रत्येक मिनट पर 85% और 95% इथेनॉल इथेनॉल में धो
- 100% इथेनॉल में धो: आरटी, 30 मिनट. इसे एक बार दोहराएँ.
- 4 में स्टोर ° C जारी रखने के लिए या.
- 100% xylene में धो: आरटी, 30 मिनट. इसे एक बार दोहराएँ.
- 60 डिग्री सेल्सियस, 45 मिनट: / xylene आयल (1:1) के साथ समझो.
- 60 डिग्री सेल्सियस, 20 मिनट 100% आयल के साथ समझो. यह दो बार दोहराएँ.
- Molds के एम्बेडिंग में एम्बेड.
5. सेक्शनिंग
- एक सूक्ष्म तक्षणी का उपयोग एम्बेडेड आँख की 15 सुक्ष्ममापी वर्गों तैयार.
- एक जिलेटिन लेपित स्लाइड पर नजर वर्गों प्लेस और यह एक गर्म स्लाइड पर छोड़ दें.
6. धुंधला हो जाना
- जगह 10 मिनट के लिए xylene में स्लाइड. इसे और अधिक एक बार दोहराएँ.
- में हाइड्रेट: 100%, 95%, 80%, 70%, 1 मिनट प्रत्येक के लिए 30% इथेनॉल
- डि पानी में एक मिनट के लिए कुल्ला.
- पीबीएस में 15 मिनट के लिए धोएं.
- 15 मिनट के लिए PBST (0.2% पीबीएस में 100 Triton एक्स) में धो.
- पीबीएस में 15 मिनट के लिए धोएं.
- एक घंटे के लिए समाधान (10% बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी) अवरुद्ध में रखें.
- प्राथमिक एंटीबॉडी में रात भर के लिए रखें.
- पीबीएस में 15 मिनट के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी धो.
- 15 मिनट के लिए PBST में धो डालें.
- पीबीएस में 15 मिनट के लिए धोएं.
- माध्यमिक एंटीबॉडी में 2 घंटे के लिए अंधेरे में प्लेस (पीबीएस में 1:100 कमजोर पड़ने).
- 15 प्रत्येक और फिर माउंट मिनट के लिए Pbs, PBST और PBS में धो डालें.
- एक प्रतिदीप्ति खुर्दबीन के नीचे स्लाइड देखो.
7. प्रतिनिधि परिणाम:
संवर्धन न्यूट ir की यह प्रक्रियाहै कोशिकाओं पृष्ठीय और उदर IPE कोशिकाओं की पुनर्जनन क्षमता का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया है. इसके अलावा, यह भी संभव है कि न्यूट की आंखों में लेंस उत्थान तंत्र दिशा में योगदान के लिए विशिष्ट जीन का अध्ययन. जब कोशिकाओं 2 सप्ताह के लिए संवर्धित किया गया है (चित्रा 1) वे जीन द्वारा ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है लेंस के उत्थान में उनके कार्य की जांच. ब्याज की विशेष जीन है कि उदर परितारिका प्रेरित हो सकता है. चूंकि वेंट्रल परितारिका कोशिकाओं लेंस transdifferentiate नहीं कर सकते हैं (चित्रा 2) एक उम्मीदवार जीन के अधिष्ठापन समारोह का अध्ययन किया जा सकता है . अतीत में, हम इस तकनीक का उपयोग कर दिखाया है कि जब छह 3 पर retinoic एसिड लेंस प्रेरण की उपस्थिति में व्यक्त किया गया था वेंट्रल परितारिका 6 से मनाया गया. चित्रा 3 में हम देख सकते है कि वेंट्रल परितारिका कुल एक पूर्ण विकसित और विभेदित (arrowhead) लेंस, पृष्ठीय परितारिका (तीर) से मेजबान के लेंस से अलग नहीं जन्म दिया है.
चित्रा 1. 2 सप्ताह की अवधि के लिए इन विट्रो में) पृष्ठीय परितारिका pigmented उपकला कोशिकाओं सुसंस्कृत . ख) ventral परितारिका pigmented उपकला कोशिकाओं 2 सप्ताह की अवधि के लिए इन विट्रो में सुसंस्कृत. ध्यान दें कि pigmentation के दोनों पृष्ठीय और उदर परितारिका कोशिकाओं में इस चरण के लिए बनी रहती है.
चित्रा 2. सुसंस्कृत IPE कोशिकाओं की पुनर्जनन क्षमता. a) पृष्ठीय IPE सेल कुल (arrowhead) से लेंस प्रेरण. होस्ट लेंस प्रेरण पृष्ठीय परितारिका (तीर), Di से: पृष्ठीय परितारिका, vi: उदर परितारिका, ले: लेंस उपकला, वामो: लेंस फाइबर. ख) वेंट्रल IPE सेल कुल (arrowhead) से लेंस प्रेरण की अनुपस्थिति. होस्ट पृष्ठीय परितारिका (तीर) से लेंस प्रेरण.
चित्रा 3. लेंस प्रेरण से उदर कुल छह 3 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट और retinoic एसिड के साथ इलाज किया. होस्ट पृष्ठीय परितारिका (तीर) से लेंस प्रेरण. उदर कुल (arrowhead) से लेंस प्रेरण.
Discussion
इस प्रोटोकॉल newts में लेंस उत्थान तंत्र का अध्ययन इन विट्रो प्रणाली में स्थापित किया गया है. समुच्चय के बाद से (या तो पृष्ठीय या ventral ईमानदारी में इस तकनीक के उत्थान के दौरान vivo व्यवहार में उनके जबरदस्त newts में transgenesis के लिए आवश्यक है और समारोह के लाभ के रूप में अच्छी तरह के रूप में समारोह 7,8,9 प्रयोगों के नुकसान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रयास को कम कर सकते हैं का पालन करें. , समुच्चय या irises एक पूरे के रूप में आसानी से वृद्धि कारकों के साथ इलाज किया जा सकता है और उनके प्रभाव के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित की जांच उदाहरण के लिए बीएमपी मार्ग की भूमिका इस 6 तकनीक का उपयोग करने के लिए अध्ययन किया गया है..
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
यह काम एक NIH अनुदान Ey10540 द्वारा पैट के लिए वित्त पोषित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
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