Summary
In tritone, la lente rigenera sempre da l'iride dorsale da transdifferenziazione delle cellule epiteliali pigmentate dell'iride (IPES). Qui si descrive una procedura per le cellule tritone cultura dorsale e ventrale IPE e il loro impianto per l'occhio tritone. Le cellule impiantate sono poi studiati da sezionare tessuti e immunoistochimica.
Abstract
Come salamandre e tritoni axolotl possedere la capacità di rigenerare molte delle sue parti del corpo perse, come gli arti, la coda con il midollo spinale, occhio, cervello, cuore, la mascella 1. In particolare, tritoni sono unici per la sua capacità lente rigenerazione. Al momento la rimozione della lente, le cellule IPE della dorsale iride transdifferenziarsi alle cellule lente ed eventualmente formare un nuovo obiettivo in circa un mese 2,3. Questa proprietà di rigenerazione non è mai esibito dalle cellule ventrale iride. Il potenziale di rigenerazione delle cellule dell'iride può essere studiato facendo trapianti di cellule coltivate in vitro IPE. Per la cultura, le cellule dorsali e ventrali dell'iride vengono prima isolati dall'occhio e coltivate separatamente per un periodo di 2 settimane (Figura 1). Queste cellule in coltura sono riaggregate e trapiantate a occhio tritone. Studi precedenti hanno mostrato che il reaggregate dorsale mantiene la sua capacità di formare lente, mentre l'aggregato ventrale non forma una lente, ricapitolando, quindi il processo in vivo (Figura 2) 4,5. Questo sistema di determinazione del potenziale di rigenerazione dorsale e ventrale cellule dell'iride è molto utile per studiare il ruolo dei geni e delle proteine coinvolte nella rigenerazione lente.
Protocol
1. Iris colture cellulari
- Raccogliere i bulbi oculari da 7 tritoni (anestetizzati nel 0,1% etilici degli acidi metano 3-amminobenzoato solfonico preparati in PBS) e il luogo di calcio magnesio libero Hanks soluzione (CMF).
- Cambiare i guanti e il lavoro all'interno della cappa coltura di tessuti.
- Sterilizzare le palle degli occhi in Lugol's-EtOH per 3 secondi.
- Lavare 2 volte in CMF.
- Trasferimento occhi Hanks e iniziare la dissezione.
- Sezionare iride-cornea complesso e rimuovere retina neurale.
- Trasferimento complessi in un nuovo piatto di Hanks.
- Utilizzando # 15 bisturi, complessi separati in due parti dorsali e ventrali.
- Rimuovere frammenti dell'iride (ventrale prima) e mettere in un piatto contenente 1 ml L-15.
- Aggiungere il 15% (150 ul) volume di dispasi (7,5 unità / ml di concentrazione).
- Incubare a 27 ° C per 2 ore (piatto avvolgere con parafilm).
- Isolare le cellule IPE da stroma (tripsina Luogo soluzione a 27 ° C).
- Raccogliere le cellule IPE in una provetta da 1,5 ml.
- Centrifugare a 1000 rpm a temperatura ambiente (temperatura ambiente) per 2 minuti, rimuovere il surnatante.
- Lavare con 1 ml di Hanks e centrifugare a 1000 rpm a temperatura ambiente per 2 minuti, rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina; incubare per 2 ore a 27 ° C.
- Centrifugare a 1000 rpm a temperatura ambiente per 2 minuti, togliere tripsina.
- Aggiungere 1 ml L-15 da lavare, centrifugare a 1000 rpm per 2 minuti.
- Aggiungere 800 ul L-15, pipetta lentamente su e giù ~ 10 volte (più di 12 volte riduce l'aderenza).
- Piastra le cellule IPE su un piatto ben 24 collagene rivestito e incubare a 27 ° C per 2 settimane (di solito, 4 dorsali e ventrali 4 pozzi sono ottenuti da 7 tritoni).
- In questa fase le cellule sono adatti per la trasfezione genica e la terapia con i fattori per determinare il loro ruolo nell'indurre o interferire con la rigenerazione della lente.
2. L'aggregazione delle cellule Iris
- Per le piastre contenenti cellule dell'iride aggiungere 20μl di soluzione dispasi a 400 microlitri di media, agitare delicatamente.
- Incubare le piastre a 27 ° C per il pernottamento.
- Pipettare delicatamente su e giù per staccare le cellule
- Cellule posto in provetta Eppendorf e centrifugare per 2 minuti a 1000 rpm a temperatura ambiente.
- Rimuovere medio e lavare con l'aggiunta di 1 ml completo L-15, spin 2 minuti a 1000 rpm a temperatura ambiente, rimuovere media.
- 2000-7000 cellule per uso aggregato. Aggiungere 200 ul L-15 per aggregare in ciascuna provetta.
- Celle divise (200 microlitri) in nuovi tubi eppendorf.
- Rotazione a 1000 rpm per 2 minuti a temperatura ambiente.
- Incubare per 48 ore a 27 ° C.
3. L'impianto di cellule Aggregrated
- Praticare un'incisione nella cornea dell'occhio tritone e rimuovere la lente.
- Dopo la rimozione dell'obiettivo, posto l'aggregato IPE cellula appena sotto il tessuto corneale sul lato ventrale dell'occhio.
- I tritoni sono conservati per un mese per far loro rigenerare l'obiettivo.
4. Incorporare di Eye Newt
- Rimuovere gli occhi tritone impiantati con l'aggregato e collocarlo in tampone fosfato (PBS).
- Fissare in paraformaldeide 4% a 4 ° C per almeno 4 ore o durante la notte.
- Lavare in PBS, 4 ° C per 30 minuti.
- Trattare con soluzione salina allo 0,85%: 4 ° C, 30 minuti.
- Lavare a Saline / etanolo (1:1): RT per 15 minuti.
- Lavare in etanolo al 70%: RT, 15 minuti. Ripetere una volta.
- Lavare in 85% etanolo e 95% etanolo a temperatura ambiente, 30 minuti ciascuno
- Lavare in etanolo al 100%: RT, 30 minuti. Ripetere una volta.
- Conservare a 4 ° C o continuare.
- Lavare in 100% xilene: RT, 30 minuti. Ripetere una volta.
- Trattare con xilene / paraffina (1:1): 60 ° C, 45 minuti.
- Trattare con il 100% paraffina: 60 ° C, 20 minuti. Ripetere altre due volte.
- Incorpora in embedding stampi.
5. Sezionamento
- Preparare 15 sezioni micron dell'occhio incorporato usando un microtomo.
- Posizionare le sezioni occhio su un vetrino ricoperto di gelatina e lasciare su un vetrino più caldo.
6. Colorazione
- Luogo diapositive in xilene per 10 minuti. Ripetere ancora una volta.
- Idrato in: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% di etanolo per 1 minuto ogni
- Sciacquare in acqua deionizzata per un minuto.
- Lavare in PBS per 15 minuti.
- Lavare in PBST (0,2% Triton X-100 in PBS) per 15 minuti.
- Lavare in PBS per 15 minuti.
- Posto nel bloccare soluzione (Anticorpi di capra 10% secondaria) per un'ora.
- Luogo in anticorpo primario per il pernottamento.
- Lavare l'anticorpo primario in PBS per 15 minuti.
- Lavare in PBST per 15 minuti.
- Lavare in PBS per 15 minuti.
- Luogo in anticorpo secondario per 2 ore al buio (diluizione 1:100 in PBS).
- Lavare in PBS, PBST, e PBS per 15 minuti ciascuna e quindi montare.
- Osservare i vetrini al microscopio a fluorescenza.
7. Rappresentante dei risultati:
Questa procedura di coltura tritone irè cellule è stato utilizzato per studiare il potenziale di rigenerazione della dorsale e ventrale le cellule IPE. Inoltre, è anche possibile studiare specifici geni che contribuiscono al meccanismo di rigenerazione lente nell'occhio tritone. Quando le cellule sono state coltivate per 2 settimane (Figura 1) possono essere transfettate con geni di esaminare la loro funzione di rigenerazione lente. Di particolare interesse sono i geni che potrebbero indurre l'iride ventrale. Dal momento che le cellule ventrale dell'iride non può transdifferenziarsi di lente (Figura 2) la funzione induttiva di un gene candidato può essere studiato. In passato, con questa tecnica abbiamo dimostrato che quando sei-3 è stato sopra espresso in presenza di induzione lente acido retinoico è stato osservato dal ventrale iride 6. In figura 3 possiamo vedere che l'aggregato ventrale iride ha dato luogo a una lente completamente cresciuto e differenziata (punta di freccia), non diverso da quello l'obiettivo host dalla dorsale iride (freccia).
Figura 1. a) dorsali iride cellule epiteliali pigmentate coltivati in vitro per un periodo di 2 settimane. b) ventrale iride cellule epiteliali pigmentate coltivati in vitro per un periodo di 2 settimane. Si noti che pigmentazione persiste a questa fase sia in dorsali e ventrali cellule dell'iride.
Figura 2. Capacità di rigenerazione delle colture di cellule IPE. a) induzione obiettivo da dorsale aggregato di cellule IPE (punta di freccia). Host induzione lente dalla dorsale iride (freccia), di: iris dorsale, vi: ventrale iris, le: epitelio lente, lf: le fibre lente. b) Assenza di induzione lente da ventrale aggregato di cellule IPE (punta di freccia). Host induzione lente dalla dorsale iride (freccia).
Figura 3. Induzione obiettivo da aggregato ventrale transfettate con sei-3 e trattati con acido retinoico. Host induzione lente dalla dorsale iride (freccia). Induzione obiettivo da aggregare ventrale (punta di freccia).
Discussion
Questo protocollo ha stabilito un sistema in vitro per studiare meccanismi di rigenerazione lente tritoni. Dal momento che gli aggregati (sia dorsale o ventrale seguire fedelmente il loro comportamento in vivo durante la rigenerazione questa tecnica può alleviare l'enorme sforzo richiesto per transgenesi in tritoni e può essere utilizzato per guadagno di funzione così come la perdita di esperimenti funzione 7,8,9. Anche , gli aggregati o l'iride nel suo complesso può essere facilmente trattati con fattori di crescita e di esaminare i loro effetti come descritto in questo protocollo. Ad esempio il ruolo di BMP percorso è stato studiato con questa tecnica 6.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato da una sovvenzione al NIH Ey10540 PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
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