Summary
Newt, lens, iris pigmente epitel hücreleri (IPEs) transdiferansiye dorsal iris her zaman yeniler. Burada newt göz kültür dorsal ve ventral newt IPE hücreleri ve implantasyon için bir prosedür açıklanmaktadır. Implante edilen hücreler daha sonra doku kesit ve immünohistokimya tarafından incelenir.
Abstract
Newt ve axolotl gibi Semenderler kayıp vücut parçaları gibi uzuvların, omurilik, göz, beyin, kalp, çene 1 ile kuyruk gibi pek çok yeniden yeteneğine sahip. Özellikle, SBD objektifi rejenerasyon yeteneği için benzersiz. Objektif kaldırılması üzerine, dorsal iris IPE hücrelerinin lens hücrelerinin transdifferentiate ve sonunda, yaklaşık bir ay 2,3 yeni bir mercek formu . Bu özellik, rejenerasyon ventral iris hücreleri tarafından sergilenen asla. Iris hücrelerinin yenilenme potansiyeli, in vitro kültür IPE hücrelerinin nakli yaparak incelenebilir. Kültür, dorsal ve ventral iris hücreleri ilk göz izole edilir ve 2 hafta (Şekil 1) bir süre için ayrı ayrı kültür. Bu kültür hücreleri reaggregated ve geri newt göz implante. Geçmişte yapılan çalışmalar, ventral toplam 4,5 (Şekil 2), in vivo sürecinde böylece yansıtan bir mercek formu gelmez ise dorsal reaggregate objektif oluşturan kapasitesi koruduğunu göstermiştir. Dorsal ve ventral iris hücrelerinin yenilenme potansiyeli belirleme sistemi objektif rejenerasyon ilgili genler ve proteinlerin rolü eğitim çok yararlı olur.
Protocol
1. İris Hücre Kültürü
- 7 SBD (anestezi, PBS içinde hazırlanan 3-aminobenzoate metan sülfonik asit etil% 0.1) ve kalsiyum magnezyum ücretsiz Hanks solüsyonu (CMF) yer gözbebekleri toplayın.
- Eldivenleri değiştirin ve doku kültürü kaputu çalışır.
- Lugol's-EtOH göz topları 3 saniye süreyle sterilize edin.
- CMF 2 kez yıkayın.
- Hanks gözleri aktarın ve diseksiyon başlayın.
- Iris kornea kompleks inceleyin ve nöral retina kaldırmak.
- Kompleksleri Hanks yeni bir çanak içine aktarın.
- # 15 bistüri, ayrı kompleksleri, sırt ve karın yarısı içine kullanma.
- 1 ml L-15 içeren bir tabak içinde iris parçaları (ilk ventral) ve yer çıkarın.
- % 15 (150 ul) dispase hacmi (7.5 adet / ml konsantrasyon) ekleyin.
- 27 ° C (parafilm sarın yemek) 2 saat süreyle inkübe edin.
- Stroma (27 Place tripsin çözüm ° C) IPE hücrelerin izole.
- 1.5 ml tüp içine IPE hücreleri toplayın.
- RT 1000 rpm (oda sıcaklığında) 2 dakika süreyle santrifüj, supernatant çıkarın.
- RT 1000 devirde 2 dakika boyunca 1 ml Hanks ve santrifüj ile yıkayınız süpernatant kaldırmak.
- 2 saat boyunca inkübe 27 ° C, 1 ml tripsin çözüm ekle
- 2 dakika boyunca oda sıcaklığında 1000 rpm'de santrifüj, tripsin çıkarın.
- 2 dakika 1000 rpm'de santrifüj, yıkamak için 1 ml L-15 ekleyin.
- Yavaş yavaş yukarı ve aşağı 800 ul L-15, pipetlemeyin ~ 10 kat (12 kat fazla bağlılık azaltır) ekleyin.
- Plaka 27 24 iyi kollajen kaplı plaka ve inkübe IPE hücreleri ° C 2 hafta (Genellikle, 4 dorsal ve ventral 4 kuyulardan 7 SBD elde edilen).
- Bu aşamada hücre, gen transfeksiyon veya indükleyen veya lens rejenerasyon ile müdahale rollerini belirlemek için faktörler ile tedavi için uygundur.
2. İris Hücreler Birleştirilmesi
- Plakalar içeren iris hücreleri hafifçe 400 inoküle, girdap dispase çözüm 20μl ekleyin.
- Plakalar 27 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
- Pipetleyin yavaşça yukarı ve aşağı hücreleri çıkarmak için
- Eppendorf tüp ve RT az 1000 rpm'de 2 dakika spin icine koyun hücreleri.
- 1 ml tam L-15 ekleyerek orta ve yıkama çıkarın, oda sıcaklığında 1000 rpm'de 2 dakika döndürmek orta kaldırmak.
- Toplam ortalama 2000-7000 hücreleri kullanın. Her bir tüp içine agrega başına 200 ul L-15 ekleyin.
- Yeni Eppendorf tüpleri böler hücreleri (200 ul).
- 2 dakika süreyle 1000 rpm'de RT dönerler.
- 48 saat boyunca inkübe 27 ° C.
3. Aggregrated Hücreler implantasyonu
- Newt gözün kornea bir yarık olun ve objektif çıkarın.
- Lens çıkarıldıktan sonra, ventral tarafında gözün kornea dokusunun hemen altında IPE hücre agrega yerleştirin.
- SBD onlara lens yeniden sağlamak için bir ay süre ile muhafaza edilir.
4. Newt Göz gömülmesi
- Agrega ile implante newt gözleri kaldırın ve fosfat tamponlu salin (PBS).
- En az 4 saat veya gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehid sabitleyin.
- PBS, 4 ° C de 30 dakika yıkayın.
- 4 ° C, 30 dakika: 0.85% serum fizyolojik ile şımartın.
- RT: Tuzlu / Ethanol (1:1) 15 dakika boyunca yıkayın.
- % 70 Etanol Yıkama: RT, 15 dakika. Bir kez tekrarlayın.
- RT, her biri 30 dakika% 85 Etanol ve% 95 Etanol yıkayın.
- % 100 Etanol Yıkama: RT, 30 dakika. Bir kez tekrarlayın.
- Mağaza, 4 ° C veya devam.
- % 100 ksilen Yıkama: RT, 30 dakika. Bir kez tekrarlayın.
- 60 ° C, 45 dakika ksilen / parafin (1:1) ile tedavi.
- 60 ° C'de 20 dakika:% 100 Parafin ile şımartın. Iki kez daha tekrarlayın.
- Kalıpları gömme gömün.
5. Kesit
- Gömülü göz 15 mikron bölümleri mikrotom kullanarak hazırlayın.
- Jelatin kaplı bir slayt göz bölümleri yerleştirin ve sıcak bir slayt bırakın.
6. Boyanma
- Place 10 dakika için ksilen slaytlar. Bir kez daha tekrarlayın.
- Hidrat:% 100,% 95,% 80,% 70,% 30 etanol her biri için 1 dakika
- Bir dakika için DI suyla durulayın.
- PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın.
- PBST (% 0.2 Triton-X 100 PBS içinde) 15 dakika boyunca yıkayın.
- PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın.
- Solüsyonu (% 10 keçisi sekonder antikoru) bir saat boyunca bloke yerleştirin.
- Gece için primer antikor yerleştirin.
- Primer antikor PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın.
- PBST 15 dakika boyunca yıkayın.
- PBS içinde 15 dakika boyunca yıkayın.
- Yeri karanlıkta 2 saat için sekonder antikoru (1:100 seyreltme PBS).
- Her biri ve daha sonra montaj için 15 dakika PBS, PBST ve PBS içinde yıkayın.
- Floresan mikroskop altında slaytlar uyun.
7. Temsilcisi Sonuçlar:
Kültür newt ir Bu prosedürolan hücreler dorsal ve ventral IPE hücrelerin yenilenme potansiyelini incelemek için kullanılmıştır. Ayrıca, newt gözünde lens yenilenme mekanizması katkıda belirli genlerin çalışma da mümkündür. Hücreleri, 2 hafta boyunca kültüre edilmiştir (Şekil 1) objektif yenilenme fonksiyonunu incelemek için genler tarafından transfekte olabilir . Özellikle ilgi çekici olan ventral iris neden olabilir genler. Ventral iris hücrelerinin lens transdifferentiate olamayacağına göre (Şekil 2) bir aday gen endüktif işlevi incelenebilir. Geçmişte, bu tekniği kullanarak altı-3 üzerinden retinoik asit lens indüksiyon huzurunda ifade edildi ventral iris 6 gözlenen olduğunu göstermiştir. Şekil 3'te ventral dorsal iris (ok) ev sahibi lens farklı değil, tam olarak gelişmiş bir ve farklılaşmış bir lens (ok ucu), iris agrega sebebiyet verdiğini görebilirsiniz.
Şekil 1. a) Dorsal iris pigmente epitel hücreleri 2 haftalık bir süre için in vitro kültür. b) Ventral iris pigmente epitel hücreleri, 2 haftalık bir süre için in vitro kültüre . Pigmentasyon hem dorsal ve ventral iris hücreleri bu aşamada devam edin.
Şekil 2. Kültürlü IPE hücrelerin yenilenmesi yeteneği. a) Objektif dorsal IPE hücre agrega (ok ucu) indüksiyon. Objektif indüksiyon dorsal iris (ok), di Host: dorsal iris, vi: ventral iris le: lens epitel, lf: lens lifleri. b) objektif indüksiyon ventral IPE hücre agrega (ok ucu) olmaması. Dorsal iris (ok) lens indüksiyon ev sahipliği yapmaktadır.
Şekil 3. Lens indüksiyon ventral toplam altı-3 ile transfekte ve retinoik asit ile tedavi. Dorsal iris (ok) lens indüksiyon ev sahipliği yapmaktadır. Ventral agrega (ok ucu) Lens indüksiyon.
Discussion
Bu protokol SBD lens yenilenme mekanizmasını çalışma in vitro sistemi kurmuştur. Agrega bu yana (ya dorsal veya ventral sadakatle rejenerasyon bu tekniği sırasında in vivo davranış SBD yılında transgenesis için gerekli ve fonksiyon kazanç yanı sıra, fonksiyon deneyler 7,8,9 kaybı için kullanılabilir büyük çaba hafifletmek izleyin . , bir bütün olarak agrega veya süsen, büyüme faktörleri ile kolayca tedavi edilen ve bu protokol açıklandığı gibi bunların etkilerini incelemek. Örneğin BMP yolun rol, bu tekniği 6 kullanılarak incelenmiştir olabilir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma PAT için bir Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe Ey10540 tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
- Hayashi, T. Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration. Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).
- Grogg, M. W. BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration. Nature. 438, 858-862 (2005).
- Nakamura, K. miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking. PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).
- Madhavan, M. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).
- Maki, N. Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo. FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).
