Summary
ב סלמנדרה, העדשה מחדש תמיד מתוך איריס הגבי על ידי transdifferentiation של תאים פיגמנט אפיתל קשתית (IPEs). כאן אנו מתארים את הליך הגבי ו הגחון התרבות תאים סלמנדרה פטרוכימיים ההשתלה שלהם לעין סלמנדרה. התאים המושתלים נלמדים מכן על ידי חתך רקמות אימונוהיסטוכימיה.
Abstract
סלמנדרות כמו סלמנדרה ו האמביסטומה להחזיק את היכולת להתחדש רבים של חלקים שאבדו שלה הגוף כגון גפיים, זנב עם חוט השדרה עיניים, מוח, לב, הלסת 1. באופן ספציפי, סלמנדרות ייחודיים ביכולתה העדשה התחדשות. לאחר הסרת העדשות, תאים IPE של הקשתית הגב transdifferentiate לתאי העדשה ולבסוף טופס עדשה חדשה בעוד כחודש 2,3. מאפיין זה של התחדשות לעולם לא הוצגו על ידי התאים הגחון איריס. פוטנציאל התחדשות של תאים קשתית ניתן ללמוד על ידי ביצוע השתלות של תאים במבחנה IPE תרבותי. עבור התרבות, התאים הגבי ו הגחון איריס מבודדים הראשון בעין ותרבותי בנפרד עבור פרק זמן של שבועות 2 (איור 1). תאים אלה בתרבית הם reaggregated ו מושתל חזרה העין סלמנדרה. מחקרים שנעשו בעבר הראו כי reaggregate הגבי שומרת יכולת להרכיב עדשות שלה בעוד המצרפי הגחון אינו טופס עדשה, השחזור, וכך בתהליך vivo (איור 2) 4,5. שיטה זו של קביעת פוטנציאל התחדשות של תאים הגבי ו הגחון איריס שימושית מאוד ללמוד את התפקיד של גנים וחלבונים המעורבים התחדשות העדשה.
Protocol
1. איריס תרבית תאים
- איסוף העיניים של 7 סלמנדרות (הרדים ב 0.1% אתיל חומצה 3-aminobenzoate מתאן sulfonic שהוכנו PBS) וכן מקום מגנזיום סידן חופשי הנקס פתרון (CMF).
- שנה כפפות עבודה למכסה המנוע בתרבית רקמה.
- לעקר כדורי העין Lugol's-EtOH למשך 3 שניות.
- לשטוף 2 פעמים ב CMF.
- העברת עיניים הנקס ולהתחיל לנתיחה.
- לנתח אירוס-הקרנית מורכבת להסיר הרשתית העצבית.
- העברת מתחמי לתוך תבשיל חדש של הנקס.
- באמצעות # 15 אזמל, מתחמי נפרד לחצאים הגבי ו הגחון.
- הסר שברי קשתית (הגחון הראשונה) ומניחים בצלחת המכילה 1 מ"ל L-15.
- הוסף 15% (150 UL) נפח dispase (7.5 יחידות / ריכוז מ"ל).
- לדגור על 27 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות (צלחת לעטוף עם parafilm).
- לבודד תאים IPE מ stroma (טריפסין מקום פתרון בשעה 27 ° C).
- איסוף תאים IPE לתוך צינור 1.5 מ"ל.
- צנטריפוגה בסל"ד 1000 ב RT (טמפרטורת החדר) למשך 2 דקות, להסיר supernatant.
- לשטוף עם 1 מ"ל הנקס צנטריפוגות ב 1000 סל"ד ב RT במשך 2 דקות, להסיר supernatant.
- הוסף 1 מ"ל פתרון טריפסין, דגירה עבור 2 שעות 27 ° C.
- צנטריפוגה ב 1000 סל"ד ב RT במשך 2 דקות, להסיר טריפסין.
- הוסף 1 מ"ל L-15 לשטוף, צנטריפוגה בסל"ד 1000 למשך 2 דקות.
- הוסף ul 800 L-15, pipet לאט למעלה ולמטה ~ 10 פעמים (יותר מ 12 פעמים מקטין הדבקות).
- פלייט התאים IPE בצלחת 24 קולגן גם לדגור מצופה על 27 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות (בדרך כלל, 4 הגבי ו 4 בארות הגחון מתקבלים 7 סלמנדרות).
- בשלב זה תאים מתאימים transfection גן או טיפול עם גורמים כדי לקבוע את תפקידם או גרימת הפרעה התחדשות העדשה.
2. צבירה של תאים איריס
- כדי צלחות המכיל תאים איריס להוסיף 20μl של פתרון dispase עד בינוני 400 מערבולת μl, בעדינות.
- דגירה צלחות על 27 מעלות צלזיוס למשך לילה.
- Pipet בעדינות מעלה ומטה כדי לסלק תאים
- המקום התאים לתוך צינור Eppendorf ספין 2 דקות בסל"ד 1000 ב RT.
- הסר בינוני לשטוף ידי הוספת L-15 שלם 1 מ"ל, ספין 2 דקות בסל"ד 1000 ב RT, להסיר בינוני.
- השתמש 2000-7000 התאים לכל המצרפי. הוסף ul 200 L-15 לכל המצרפי לתוך צינור אחד.
- פיצול תאים (200 μl) לתוך צינורות חדשים Eppendorf.
- ספין בסל"ד 1000 דקות 2 ב RT.
- דגירה של 48 שעות ב 27 ° C.
3. השרשה של תאים Aggregrated
- ביצוע חתך בקרנית העין סלמנדרה ולהסיר את העדשה.
- לאחר הסרת העדשות, המקום המצרפי תא IPE ממש מתחת רקמת הקרנית בצד הגחוני של העין.
- סלמנדרות נשמרים למשך חודש כדי לאפשר להם לחדש את העדשה.
4. והטבעה של העין ניוט
- הסר את העיניים סלמנדרה מושתל עם במצטבר ולמקם אותו פוספט בופר סליין (PBS).
- תקן ב paraformaldehyde 4% ב 4 ° C למשך לפחות 4 שעות או למשך הלילה.
- שטפי ב-PBS, 4 ° C למשך 30 דקות.
- פנקו את זה עם מלח 0.85%: 4 ° C, 30 דקות.
- להתרחץ מלוחים / אתנול (1:1): RT במשך 15 דקות.
- לשטוף באתנול 70%: RT, 15 דקות. חזור על זה פעם.
- לשטוף באתנול 85% אתנול ו 95% ב RT, 30 דקות כל אחד
- שטפי ב 100% אתנול: RT, 30 דקות. חזור על זה פעם.
- חנות ב 4 מעלות צלזיוס או להמשיך.
- שטפי ב קסילן 100%: RT, 30 דקות. חזור על זה פעם.
- פנקו עם קסילן / פרפין (1:1): 60 ° C, 45 דקות.
- פנקו עם פרפין 100%: 60 ° C, 20 דקות. חזור על זה עוד פעמיים.
- שבץ הטבעה תבניות.
5. חתך
- הכן 15 מיקרומטר חלקים של העין מוטבע באמצעות microtome.
- מניחים את הסעיפים עין בשקופית מצופה ג'לטין ולהשאיר אותה בשקופית חם.
6. הכתמה
- המקום שקופיות קסילן במשך 10 דקות. חזור על זה עוד פעם.
- מימה ב: 100%, 95%, 80%, 70%, אתנול 30% עבור כל 1 דקה
- לשטוף במים DI לרגע.
- שטפי ב PBS במשך 15 דקות.
- שטפי ב PBST (0.2% טריטון X-100 ב PBS) במשך 15 דקות.
- שטפי ב PBS במשך 15 דקות.
- מקום חסימת פתרון (נוגדן עיזים 10% משני) במשך שעה.
- מקום הנוגדן העיקרי בין לילה.
- לשטוף נוגדן ראשוני PBS במשך 15 דקות.
- שטפי ב PBST במשך 15 דקות.
- שטפי ב PBS במשך 15 דקות.
- מקום נוגדנים משני 2 שעות בחושך (1:100 דילול ב PBS).
- שטפי ב-PBS, PBST, ו pbs במשך 15 דקות כל אחד, ואז הר.
- שים את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
7. נציג תוצאות:
הליך זה של culturing סלמנדרה irתאים נוצל כדי לחקור את פוטנציאל התחדשות של הגבי לבין תאים IPE הגחון. יתר על כן, אפשר גם ללמוד גנים מסוימים שתורמים כלפי מנגנון התחדשות העדשה בעין סלמנדרה. כאשר תאים בתרבית כבר 2 שבועות (איור 1) הם יכולים להיות transfected ידי הגנים לבחון את תפקידם של התחדשות העדשה. עניין מיוחד הם גנים שעשויים לגרום הקשתית הגחון. מאז תאים הגחון קשתית לא יכול transdifferentiate העדשה (איור 2) הפונקציה אינדוקטיבי של הגן מועמד ניתן ללמוד. בעבר, השימוש בטכניקה זו הראינו כי כאשר שש 3 באה לידי ביטוי על פני בנוכחות אינדוקציה החומצה הרטינואית העדשה נצפתה מן הגחון איריס 6. באיור 3 ניתן לראות כי במצטבר הגחון איריס הולידה עדשה בוגרת הבדיל (ראש חץ), לא שונה מאשר עדשות המארח של איריס הגבי (חץ).
באיור 1. א) תאים הגב איריס פיגמנט אפיתל בתרבית במבחנה לתקופה של 2 שבועות. ב) הגחון התאים בקשתית פיגמנט אפיתל בתרבית במבחנה לתקופה של 2 שבועות. שים לב פיגמנטציה נמשכת עד לשלב זה הן הגבי ו הגחון התאים בקשתית.
איור 2. התחדשות היכולת של התאים בתרבית IPE. א) עדשה אינדוקציה מן המצרפי הגבי תא IPE (ראש חץ). מארח העדשה אינדוקציה מן איריס הגבי (חץ), די: איריס הגבי, vi: איריס הגחון, le: אפיתל העדשה, אם: סיבי העדשה. ב) העדר אינדוקציה העדשה המצרפי הגחון תא IPE (ראש חץ). מארח העדשה אינדוקציה מן איריס הגבי (חץ).
איור 3. אינדוקציה עדשה מ המצרפי הגחון transfected עם שישה-3 ו שטופלו החומצה הרטינואית. מארח העדשה אינדוקציה מן איריס הגבי (חץ). עדשה אינדוקציה מן המצרפי הגחוני (ראש חץ).
Discussion
פרוטוקול זה הקימה במערכת במבחנה ללמוד התחדשות מנגנוני העדשה סלמנדרות. מאז אגרגטים (הגבי או הגחון פעל בנאמנות שלהם בהתנהגות vivo במהלך רגנרציה בטכניקה זו יכולה להקל על מאמץ אדיר נדרש transgenesis ב סלמנדרות והוא יכול לשמש למטרות רווח של הפונקציה, כמו גם אובדן של ניסויים פונקציה 7,8,9. כמו כן , אגרגטים או אירוסים בכללותו יכול בקלות להיות מטופלים עם גורמי גדילה ולבחון את השפעתם כמתואר בפרוטוקול זה. לדוגמה את התפקיד של BMP מסלול נחקרה באמצעות טכניקה זו 6.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH Ey10540 ללטף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
- Hayashi, T. Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration. Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).
- Grogg, M. W. BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration. Nature. 438, 858-862 (2005).
- Nakamura, K. miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking. PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).
- Madhavan, M. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).
- Maki, N. Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo. FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).
