Summary
뉴트에서 렌즈는 홍채 색소 상피 세포 (IPEs)의 transdifferentiation하여 지느러미 홍채에서 항상 다시 생성합니다. 여기서 우리는 뉴트의 눈에 문화 지느러미와 복부 뉴트 IPE 세포와 그 이식하는 절차를 설명합니다. 이식 세포 그런 다음 조직 sectioning과 immunohistochemistry으로 공부하고 있습니다.
Abstract
뉴트 및 axolotl 같은 도롱뇽은 팔다리, 척수, 눈, 뇌, 심장, 턱 1 꼬리로의 손실 신체 부위 중 많은 것들을 다시 생성하는 능력을 보유하고 있습니다. 특히, newts는 렌즈 재생 기능에 대해 고유합니다. 렌즈 제거시, 지느러미 홍채의 IPE 세포는 렌즈 세포에 transdifferentiate 결국 한 달 2,3의 새로운 렌즈를 형성하고 있습니다. 중생의이 속성은 복부 홍채 세포에 의해 전시되지 않습니다. 홍채 세포의 재생 가능성은 체외 교양 IPE 세포에의 이식을하여 공부하실 수 있습니다. 문화, 지느러미 및 복부 홍채 세포가 먼저 눈에으로부터 격리되고 이주 (그림 1)의 기간 동안 별도 양식. 이러한 교양 세포 reaggregated와 뉴트 아이로 다시 심어 있습니다. 과거 연구는 복부 집계가 4,5 (그림 2) 따라서 생체내 과정에서 recapitulating, 렌즈를 형성하지 않는 반면, 지느러미 reaggregate는 렌즈를 형성 능력을 유지하는 것으로 나타났습니다. 지느러미 및 복부 홍채 세포의 재생 가능성을 결정하는이 시스템은 렌즈 재생에 관련된 유전자 및 단백질의 역할을 공부에 매우 유용합니다.
Protocol
1. 이리스 세포 배양
- 7 newts (PBS의 준비 3 aminobenzoate 메탄 sulfonic의 산성 에틸 0.1 %에 anesthetized)과 칼슘, 마그네슘 무료 행크스 솔루션 (CMF)에서 곳에서 눈알를 수집합니다.
- 장갑을 변경하고 조직 문화 후드에서 작동합니다.
- 3 초 Lugol's - EtOH의 눈 볼을 소독.
- CMF 2 번 씻으십시오.
- 행크스에 눈을 전송과 절개를 시작합니다.
- 홍채 - 각막 복잡한을 해부하다 및 신경 망막를 제거합니다.
- 행크스의 새로운 그릇에 단지를 전송합니다.
- 지느러미 및 복부 반쪽에 # 15 메스, 별도의 단지를 사용하여.
- 1 ML은 L - 15을 포함하는 접시에 홍채 조각 (최초 복부)와 장소를 제거합니다.
- 15 % (150 UL) dispase의 볼륨 (7.5 단위 / ML 농도)을 추가합니다.
- 27 2 시간 동안 ° C (parafilm와 랩 요리)에 품어.
- 스트 로마 (27시 플레이스 트립신 용액 ° C)에서 IPE 세포를 분리.
- 1.5 ML 튜브에 IPE 세포를 수집합니다.
- 이분에 대한 RT에서 1,000 RPM (실온)에서 원심 분리기, 뜨는 제거합니다.
- 2 분 동안 RT에서 1000 RPM 1 ML 행크스와 원심 분리기와 세척 뜨는 제거합니다.
- 27에서 2 시간 동안 품어 ° C., 1 ML 트립신 솔루션 추가
- 이분에 대한 RT에서 1,000 rpm으로 원심 분리기는 트립신을 제거하십시오.
- 2 분 동안 1,000 rpm으로 원심 분리기, 씻어 1 ML L - 15을 추가합니다.
- 천천히 위아래로 800 UL L - 15, pipet ~ 10 번 (이상 12 회가 부착을 줄일 수) 추가합니다.
- 플레이트 27 24 잘 콜라겐 코팅 판과 부화에 IPE 세포 ° C 이주 (보통, 4 등의 4 복부 우물이 7 newts에서 얻을 수있다)에 대한.
- 이 단계에서 세포는 유전자 transfection 또는 유도하거나 렌즈 재생을 방해하는 그들의 역할을 결정하는 요인과 치료에 적합합니다.
2. 이리스 세포의 집합
- 번호판을 포함 홍채 세포는 부드럽게 400 μl 매체 소용돌이에 dispase 솔루션의 20μl를 추가합니다.
- 27 ° C 야간에 대한 번호판을 품어.
- Pipet 부드럽게 위아래로 세포를 이동시키다하기
- Eppendorf 튜브 및 RT에서 1,000 rpm으로 2 분 스핀에 플레이스 세포.
- 1 ML 전체 L - 15을 추가하여 중간 및 세척을 제거, RT에서 1,000 rpm으로 2 분 스핀 매체를 제거합니다.
- 집합마다 2000-7000 세포를 사용합니다. 각각의 튜브로 집계 200 UL L - 15을 추가합니다.
- 새로운 eppendorf 튜브에 분할 세포 (200 μl).
- RT 2 분 1,000 rpm으로 회전.
- 27 48 시간을위한 품어 ° C.
3. Aggregrated 세포의 주입
- 뉴트의 눈 각막에 슬릿을하고 렌즈를 제거합니다.
- 렌즈 제거 후 눈 복부 측면에 바로 각막 조직 아래 IPE 세포 집계를 놓습니다.
- newts은 그들이 렌즈를 다시 생성하도록 한 달 동안 보관됩니다.
4. 뉴트 아이의 포함
- 집계로 이식 뉴트의 눈을 제거하고 인산에 배치 호수 (PBS)가 버퍼.
- 최소 4 시간 또는 밤새 4 ° C에서 4 % paraformaldehyde에 수정.
- 30 분 PBS, 4 ° C에서 씻으십시오.
- 4 ° C, 30 분 0.85 %의 식염수에 그것을 취급합니다.
- 15 분 동안 RT : 살린 / 에탄올 (1:1)에 씻으십시오.
- 70 % 에탄올에 세척 : RT, 15 분. 한번 반복합니다.
- RT 30 분 각 85 % 에탄올과 95 % 에탄올로 세척
- 100 % 에탄올에 세척 : RT, 30 분. 한번 반복합니다.
- 4 스토어 ° C 또는 계속합니다.
- 100 % 크실렌의 세척 : RT, 30 분. 한번 반복합니다.
- 60 ° C, 45 분 : 크실렌 / 파라핀 (1:1)으로 처리합니다.
- 60 ° C, 20 분 100 % 파라핀과 치료. 그것을 두 번 더 반복합니다.
- 금형을 포함에 삽입할 수 있습니다.
5. Sectioning
- 마이크로톰를 사용하여 임베디드 눈 15 μm의 섹션을 준비합니다.
- 젤라틴 코팅 슬라이드에 눈 섹션을 장소와 따뜻한 슬라이드에두고.
6. 더럽히는 것
- 이곳은 10 분 크실렌에 슬라이드. 한번 더 반복합니다.
- 의 하이드 레이트 : 100 %, 95 %, 80 %, 70 %, 일분 각 30 % 에탄올
- 잠시 디 물에 헹굼.
- 15 분 동안 PBS로 씻으십시오.
- 15 분 동안 PBST (PBS에 0.2 % 트리톤 X - 100)에 씻으십시오.
- 15 분 동안 PBS로 씻으십시오.
- 한시간 솔루션 (10 % 염소 차 항체)를 차단에 놓습니다.
- 하룻밤에 대한 기본 항체에 놓습니다.
- 15 분 동안 PBS의 기본 항체를 씻으십시오.
- 15 분 PBST로 씻으십시오.
- 15 분 동안 PBS로 씻으십시오.
- 어둠 속에서 2 시간 동안 차 항체에 플레이스 (PBS에 희석 1:100).
- 십오분 각 후 마운트를위한 PBS, PBST, 그리고 PBS로 씻으십시오.
- 형광 현미경 슬라이드를 관찰합니다.
7. 대표 결과 :
culturing 뉴트 IR의이 절차는는 세포는 지느러미와 복부 IPE 세포의 재생 가능성을 연구하기 위해 활용되었습니다. 또한, 그것은 뉴트 안구의 렌즈 재생 메커니즘으로 기여하는 특정 유전자를 연구하는 것도 가능합니다. 전지은 2 주 동안 교양되었을 경우 (그림 1) 이들은 렌즈에서 재생 기능을 조사하는 유전자로 transfected 수 있습니다. 특히 관심의 복부 아이리스 유발 유전자 수 있습니다. 복부 홍채 세포가 렌즈에 transdifferentiate 수 없기 때문에 (그림 2) 후보 유전자의 유도 기능을 공부하실 수 있습니다. 과거에는이 기법을 사용하는 우리는 여섯 3이 넘는 retinoic 산성 렌즈 유도의 존재로 표현되었을 때 복부 홍채 6 관찰되었다 것으로 나타났습니다. 그림 3에서는 복부 이리스 집계는 지느러미 홍채 (화살표)에서 호스트 렌즈와는 다른이 아닌 완전히 성장과 차별화된 렌즈 (화살촉)에 상승을 준 것을 알 수 있습니다.
그림 1. A) 도설 홍채 색소 상피 세포는 2 주 동안 체외에서 배양해. B) 복부 홍채 색소 상피 세포는 2 주 동안 체외에서 배양해. 착색은 지느러미와 복부 양쪽 홍채 세포에서이 단계로 계속합니다.
그림 2. 교양 IPE 세포의 재생 능력. 지느러미 IPE 세포 집계 (화살촉)에서) 렌즈 유도. 지느러미 홍채 (화살표), DI에서 렌즈 유도 호스트 : 지느러미 홍채, 바이 : 복부 홍채, 르 : 렌즈 상피,면 : 렌즈 섬유. 복부 IPE 세포 집계 (화살촉)에서 렌즈 유도의 B) 부재. 지느러미 홍채 (화살표)에서 렌즈를 유도 호스트.
그림 3. 복부 집계에서 렌즈 유도 여섯 - 3 transfected 및 retinoic 산성과 치료. 지느러미 홍채 (화살표)에서 렌즈를 유도 호스트. 복부 집계 (화살촉)에서 렌즈 유도.
Discussion
이 프로토콜은 newts에서 렌즈의 재생 메커니즘을 연구하기 위해 체외 시스템을 마련하였습니다. 집계 이후 (중 지느러미 또는 복부가 충실하게 자신이 재생이 기법 중 생체내 행동에 newts에 transgenesis에 필요한과 기능의 이득뿐만 아니라 기능을 실험 7, 8, 9의 손실에 대해 사용할 수있는 엄청난 노력을 경감 할 수 따릅니다. 또한 , 전체 집계 또는 붓꽃은 쉽게 성장 요소로 취급하고이 프로토콜의 설명에 그들의 영향을 조사합니다. 예를 들어 BMP 통로의 역할이 기술 6을 사용 연구되어 수 있습니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 PAT에 NIH 교부금에 의해 투자 Ey10540했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A.
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
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