Summary
I newt, återskapar linsen alltid från den dorsala iris genom transdifferentiation av iris pigmenterade epitelceller (Info-Point). Här beskriver vi ett förfarande för att kultur rygg-och ventral newt IPE celler och deras implantation till newt ögat. De implanterade cellerna sedan studeras genom vävnad snittning och immunohistokemi.
Abstract
Salamandrar som vattensalamander och Axolotl besitter förmågan att regenerera många av sina förlorade kroppsdelar, såsom ben, svans med ryggmärg, öga, hjärna, hjärta, käken 1. Specifikt salamandrar är unika för sin lins förnyelse förmåga. När linsen tas bort, IPE celler i dorsala iris transdifferentiate till Lens celler och så småningom bilda en ny lins i ungefär en månad 2,3. Denna egenskap av förnyelse är aldrig ut av den ventrala iris celler. Den förnyelse potential iris cellerna kan studeras genom att göra transplantationer av in vitro-odlade IPE celler. För kulturen, är rygg-och ventrala iris celler först isoleras från ögat och odlade separat för en tidsperiod om 2 veckor (Figur 1). Dessa odlade celler är reaggregated och implanteras tillbaka till newt ögat. Tidigare studier har visat att den dorsala reaggregate behåller sin lins bildar kapacitet medan den ventrala samlade inte utgör en lins, rekapitulera, alltså in vivo-processen (Figur 2) 4,5. Detta system för att fastställa föryngring potential rygg-och ventrala iris celler är mycket användbar för att studera rollen av gener och proteiner involverade i objektivet förnyelse.
Protocol
1. Iris Cell Culture
- Samla ögonglober från 7 vattensalamandrar (bedövas i 0,1% etyl 3-aminobensoat metan sulfonsyra upprättats i PBS) och placera i kalcium magnesium gratis Hanks lösning (CMF).
- Byt handskar och arbeta i vävnadsodling huven.
- Sterilisera öga bollar i Lugol's-EtOH i 3 sekunder.
- Tvätta två gånger i CMF.
- Överföring ögonen för Hanks och börja dissekering.
- Dissekera iris-hornhinnan komplexa och ta bort neurala näthinnan.
- Överför komplex till en ny maträtt på Hanks.
- Använda # 15 skalpell, separat komplex i rygg-och ventrala halvor.
- Ta bort iris fragment (ventrala först) och lägg i en skål med 1 ml L-15.
- Lägg till 15% (150 ul) volym dispase (7,5 enheter / ml koncentration).
- Inkubera vid 27 ° C i 2 timmar (wrap maträtt med parafilm).
- Isolera IPE celler från stroma (Ort trypsin lösning vid 27 ° C).
- Samla IPE-celler i ett 1,5 ml rör.
- Centrifugera vid 1000 rpm vid RT (rumstemperatur) under 2 minuter, ta bort supernatanten.
- Tvätta med 1 ml Hanks och centrifugera vid 1000 rpm vid RT i 2 minuter, ta bort supernatanten.
- Tillsätt 1 ml trypsin lösning, inkubera i 2 timmar vid 27 ° C.
- Centrifugera vid 1000 rpm vid RT i 2 minuter, ta trypsin.
- Tillsätt 1 ml L-15 för att tvätta, centrifugera vid 1000 rpm i 2 minuter.
- Tillsätt 800 ul L-15, Pipettera långsamt upp och ner ~ 10 gånger (mer än 12 gånger minskar följsamhet).
- Tavla IPE celler på en 24 väl kollagen plåt och inkubera vid 27 ° C i 2 veckor (vanligtvis 4 rygg och 4 ventral brunnar från 7 vattensalamandrar).
- I detta skede celler är lämpliga för gen transfektion eller behandling med faktorer för att avgöra deras betydelse för att framkalla eller störa linsen regeneration.
2. Sammanläggning av Iris celler
- Till plattorna innehåller iris celler lägga 20μl av dispase lösning på 400 l medium, snurra försiktigt.
- Inkubera plattorna vid 27 ° C över natten.
- Pipettera försiktigt upp och ner för att avlägsna celler
- Placera celler till Eppendorf-rör och centrifugera i 2 minuter vid 1000 rpm vid RT.
- Ta medium och tvätta genom att tillsätta 1 ml komplett L-15, snurra 2 minuter vid 1000 rpm vid RT, ta bort mediet.
- Använd 2000-7000 celler per aggregat. Tillsätt 200 ul L-15 per aggregat i varje rör.
- Dela celler (200 l) i nya Eppendorf-rör.
- Spin vid 1000 rpm i 2 minuter vid RT.
- Inkubera 48 timmar vid 27 ° C.
3. Implantation av Aggregrated celler
- Gör ett snitt i hornhinnan i newt ögat och ta ut linsen.
- Efter linsen tas bort, placera IPE cellen sammanlagda strax under hornhinnan vävnad på den ventrala sidan av ögat.
- De salamandrar hålls för en månad för att låta dem regenerera linsen.
4. Inbäddning av Newt Eye
- Ta bort newt ögonen implanteras med samlade och placera den i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Fix i 4% paraformaldehyd vid 4 ° C under minst 4 timmar eller över natten.
- Tvätta i PBS, 4 ° C i 30 minuter.
- Behandla den med 0,85% saltlösning: 4 ° C, 30 minuter.
- Tvätta i Saline / etanol (1:1): RT i 15 minuter.
- Tvätta i 70% etanol: RT, 15 minuter. Upprepa det en gång.
- Tvätta i 85% etanol och 95% etanol vid RT, 30 minuter
- Tvätta i 100% Etanol: RT, 30 minuter. Upprepa det en gång.
- Förvaras vid 4 ° C eller fortsätta.
- Tvätta i 100% xylen: RT, 30 minuter. Upprepa det en gång.
- Behandla med xylen / paraffin (1:1): 60 ° C, 45 minuter.
- Behandla med 100% Paraffin: 60 ° C, 20 minuter. Upprepa det två gånger till.
- Bädda in inbäddning formar.
5. Sektionering
- Förbered 15 ìm delar av den inbäddade ögat med hjälp av en mikrotomen.
- Placera ögat avsnitten om ett gelatin bestruket bild och lämna den på en bild varmare.
6. Färgning
- Placera objektglasen i xylen i 10 minuter. Upprepa en gång till.
- Hydrate i: 100%, 95%, 80%, 70%, 30% etanol för 1 minut vardera
- Skölj i DI vatten i en minut.
- Tvätta i PBS i 15 minuter.
- Tvätta i PBST (0,2% Triton-X 100 i PBS) i 15 minuter.
- Tvätta i PBS i 15 minuter.
- Placera i blockerande lösningen (10% get sekundär antikropp) i en timme.
- Placera i primär antikropp för övernattning.
- Tvätta primära antikroppen i PBS i 15 minuter.
- Tvätta i PBST i 15 minuter.
- Tvätta i PBS i 15 minuter.
- Placera i sekundär antikropp i 2 timmar i mörker (1:100 utspädning i PBS).
- Tvätta i PBS, PBST, och PBS i 15 minuter vardera och sedan montera.
- Observera glider under ett fluorescensmikroskop.
7. Representativa resultat:
Detta förfarande för odling newt irär celler som har använts för att studera föryngring potential dorsala och ventrala IPE celler. Dessutom är det också möjligt att studera specifika gener som bidrar till att linsen förnyelse mekanism i newt ögat. När cellerna har odlats i 2 veckor (figur 1) kan de transfekterade av gener för att undersöka deras funktion i objektivet förnyelse. Av särskilt intresse är gener som kan orsaka den ventrala iris. Eftersom den ventrala iris cellerna inte kan transdifferentiate till linsen (Figur 2) kan den induktiva funktion en kandidat gen studeras. Förr i tiden, med hjälp av denna teknik har vi visat att när sex-3 över uttrycktes i närvaro av retinoinsyra lins induktion observerades från den ventrala iris 6. I figur 3 kan vi se att den ventrala iris samlade gav upphov till en fullvuxen och differentierad lins (pilspets), inte annorlunda än värd objektivet från rygg iris (pil).
Figur 1. a) Dorsal iris pigmenterade epitelceller odlas in vitro under en period av 2 veckor. b) på magen iris pigmenterade epitelceller odlas in vitro under en period av 2 veckor. Observera att pigmentering kvarstår att detta skede i både rygg-och ventrala iris celler.
Figur 2. Regeneration förmåga odlade IPE celler. a) Lens induktion från rygg IPE cell aggregat (pilspets). Värd lins induktion från rygg iris (pil), di: dorsal iris, VI: ventral iris, le: lins epitel, LF: lins fibrer. b) Avsaknad av objektiv induktion från ventrala IPE cell aggregat (pilspets). Värd lins induktion från rygg iris (pil).
Figur 3. Lens induktion från ventrala sammanlagda transfekterade med sex-3 och behandlas med retinoinsyra. Värd lins induktion från rygg iris (pil). Lens induktion från ventrala aggregat (pilspets).
Discussion
Detta protokoll har etablerat en in vitro-system för att studera mekanismer lins förnyelse i vattensalamandrar. Eftersom aggregaten (antingen rygg eller ventrala följer troget sitt uppträdande in vivo under regenerering denna teknik kan mildra det enorma arbete som krävs för genmodifiering i vattensalamandrar och kan användas för förstärkning av funktion samt förlust av funktion experiment 7,8,9. Också kan aggregaten eller iris som helhet lätt behandlas med tillväxtfaktorer och undersöka deras effekter som beskrivs i detta protokoll. Till exempel den roll som BMP vägen har studerats med hjälp av denna teknik 6.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Detta arbete har finansierats av en NIH bidrag Ey10540 till PAT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lugol’s solution | Sigma-Aldrich | L-6146 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H-4034 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid | Sigma-Aldrich | E-10521 | |
| Dispase | GIBCO, by Life Technologies | 17105-041 | |
| Trypsin 1:250 | GIBCO, by Life Technologies | 27250018 | |
| L-15 ( Leibovitz) | Sigma-Aldrich | L-4386 | |
| DNase 1 | Sigma-Aldrich | D5025-150KU | |
| Kanamycin Sulfate | GIBCO, by Life Technologies | 100x, 15160 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Fungizone (amphotericin B solution) | Sigma-Aldrich | A2942 | |
| 24 well collagen coated plate | BD Biosciences | 354408 |
References
- Tsonis, P. A. Regeneration in vertebrates. Dev Biol. 221, 273-284 (2000).
- Tsonis, P. A., Madhavan, M., Tancous, E. E., Del Rio-Tsonis, K. A newt's eye view of lens regeneration. Int. J. Dev. Biol. 48, 975-980 (2004).
- Del Rio-Tsonis, K., Tsonis, P. A. Eye regeneration at the molecular age. Dev. Dyn. , 226-2211 (2003).
- Okamoto, M., Ito, M., Owaribe, K. Difference between dorsal and ventral iris in lens producing potency in normal lens regeneration is maintained after dissociation and reaggregation of cells from the adult newt, Cynops pyrrhogaster. Develop Growth Differ. 40, 11-18 (1998).
- Hayashi, T. Highly efficient transfection system for functional gene analysis in adult amphibian lens regeneration. Develop Growth Differ. 43, 361-370 (2001).
- Grogg, M. W. BMP inhibition-driven regulation of six-3 underlies induction of newt lens regeneration. Nature. 438, 858-862 (2005).
- Nakamura, K. miRNAs in Newt Lens Regeneration: Specific Control of Proliferation and Evidence for miRNA Networking. PLoS One. 5, e12058-e12058 (2010).
- Madhavan, M. The role of Pax-6 in lens regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 14848-14853 (2006).
- Maki, N. Oocyte-type linker histone B4 is required for transdifferentiation of somatic cells in vivo. FASEB J. 24, 3462-3467 (2010).
