Summary
सेल की मध्यस्थता lymphocytotoxicity assays (CML) इन विट्रो में और autoreactive प्रतिक्रियाओं कोशिका मृत्यु का अध्ययन तंत्र का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हालांकि, रहने कक्ष फ्लोरोसेंट रंजक, प्रकार और सेल के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मौत उपयोग रास्ते के कैनेटीक्स के साथ confocal सूक्ष्म इमेजिंग तकनीक का उपयोग कर अधिक से अधिक विस्तार में अध्ययन किया जा सकता है.
Protocol
1. कक्षों की तैयारी
- लक्ष्य सेल संस्कृति: संस्कृति, माउस बीटा सेल लाइनों, एनआईटी-1 और एनआईटी-4 DMEM में एक पहले से वर्णित 1,2 10% FBS, 0.02% BSA, गैर आवश्यक एमिनो एसिड, 15mm HEPES, 16.5mM के साथ पूरक था Glocose और पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन. के लिए 51 करोड़, एक फ्लैट नीचे 96 5x10 4 कोशिकाओं में अच्छी तरह से संस्कृति की थाली में लेबलिंग बीज कोशिकाओं / 200 μl संस्कृति माध्यम में अच्छी तरह से. प्रयोगों माइक्रोस्कोपी, 8 अच्छी तरह लैब तक द्वितीय संभाग coverglass में चैम्बर के प्रति 4 500 μl संस्कृति माध्यम में 5x10 बीज कोशिकाओं, और cytotoxicity प्रयोगों में उपयोग करने के लिए पहले 48 घंटे के लिए बढ़ने की अनुमति.
- नियंत्रण टी सेल लाइन संस्कृति: Jurkat सेल लाइन एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में (ATCC, CD3 + मानव लिम्फोसाइट कोशिका लाइन) का उपयोग करें. संस्कृति RPMI1640 में Jurkat कोशिकाओं के साथ पूरक 10% FBS, 2 मिमी एल glutamine, 1.5 छ / एल सोडियम बिकारबोनिट, 10 मिमी HEPES और 1.0 मिमी सोडियम पाइरूवेट.
2. संग्रह और effector autoreactive CD8 + टी कोशिकाओं के सक्रियण
1Dvs/DvsJ NOD.Cg Rag1 tm1Mom टीजी (TcraAI4) [इशारा - AI4a] और NOD.Cg Rag1 tm1Mom (TcrbAI4) टीजी 1Dvs/DvsJ [इशारा - AI4b] जैक्सन प्रयोगशाला (बार हार्बर, ME) से खरीदे गए थे और हमारे माउस सुविधा में नस्ल. F1 इशारा - AI4a matings से संकर के साथ संतान इशारा - AI4b [इशारा - AI4a / ख] 3-5 सप्ताह की आयु में मधुमेह विकसित. सभी चूहों विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त सुविधाओं में रखे थे और प्रासंगिक संस्था पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित है.
- 3-4 सप्ताह पुरानी / इशारा AI4a ख सीओ 2 का उपयोग चूहों euthanize .
- चूहों से spleens लीजिए. Euthanized चूहों इथेनॉल स्प्रे के साथ तैयार कर रहे हैं और शल्य चिकित्सा हुड के नीचे खोला. Spleens हटा रहे हैं और तुरंत ठंडा HBSS बफर में डाल दिया.
- तिल्ली कोशिकाओं का उपयोग कर एक 7 एमएल कांच homogenizer लीजिए. दो से तीन spleens प्रत्येक ठंड HBSS के 5 एमएल में डाल रहे हैं और एक 7 एमएल कांच homogenizer साथ homogenized. Homogenate एकत्र की है और centrifuged 1200rpm पर 4 पर 5 मिनट के लिए डिग्री सेल्सियस Sorvall RT7 + अपकेंद्रित्र का उपयोग कर. सेल छर्रों एकत्र कर रहे हैं.
- लाल रक्त कोशिकाओं का उपयोग hypotonic समाधान उपचार निकालें. हिमपात के साथ 5 मिनट के लिए बर्फ पर 5 एमएल / समाधान तिल्ली hypotonic इलाज कर रहे हैं, तो HBSS के एक बराबर मात्रा जोड़ने के द्वारा neutralized. Centrifugation द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा, जैसा कि ऊपर, और 50 एमएल HBSS में resuspend. सेल झरनी के माध्यम से निलंबित कर दिया कोशिकाओं दर्रे और TrypanBlue धुंधला के साथ एक hemocytometer का उपयोग गिनती.
- कोशिकाओं को सक्रिय. 5x10 6 / एमएल और सक्रिय पर Resuspend कोशिकाओं RPMI1640 में 0.1 सुक्ष्ममापी AI4 mimotope (एमिनो एसिड अनुक्रम YFIENYLEL) और 25 यू / एमएल आईएल-2 के साथ एक 3 दिन की संस्कृति का उपयोग 10% FBS के साथ पूरक, 2 एल glutamine मिमी , 1.5 ग्राम / एल सोडियम बिकारबोनिट, 10 मिमी HEPES और 1.0 मिमी सोडियम पाइरूवेट.
3. 51 करोड़ रिलीज परख CML की जांच करने के लिए
- लेबल लक्ष्य कोशिकाओं: 1 में कोशिकाओं को लक्षित μCi / अच्छी तरह से और संस्कृति से 3 घंटे के लिए, और संस्कृति के माध्यम से 3 बार धोने के लिए 51 करोड़ जोड़ें.
- RPMI मध्यम 1640 में effector कोशिकाओं निलंबित के रूप में 2.5 चरण में उल्लेख किया ताकि अंतिम मात्रा प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा 200 μl है.
- लेबल लक्ष्य कोशिकाओं के अंतिम धोने के बाद, वांछित effector लक्ष्य सेल संस्कृतियों के लिए सक्रिय effector कोशिकाओं को जोड़ने के (ई: टी) लक्ष्य के अनुपात. टी अनुपात 0.4:1, 1:1, 2:01, 05:01, 10:01 20:01, और 50:1 में हम आम तौर पर ई का उपयोग करें.
- लक्ष्य कोशिकाओं के 6 कुओं ताजा संशोधित RPMI 1640 मध्यम (कदम 2.5 देखें) जोड़ें करने के लिए एक सहज lysis नियंत्रण के रूप में कार्य.
- 16 घंटे के लिए सह - संस्कृति effector और लक्ष्य कोशिकाओं.
- 6x50 मिमी निम्बुड़ा ग्लास ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए
- 100μl 2% एसडीएस जोड़ने और कई बार धीरे pipetting द्वारा कोशिकाओं lyse.
- 6x50 मिमी निम्बुड़ा ग्लास ट्यूबों के दूसरे सेट में सेल lysate लीजिए.
- कुओं को साफ एच 2 हे के साथ एक बार और धो सेल lysate ट्यूबों के लिए धो जोड़ने.
- Supernatants और सेल lysates एक गामा काउंटर का उपयोग गणना.
- के रूप में विशिष्ट lysis की गणना:
4. जीना सेल इमेजिंग के लिए कोशिकाओं का धुंधला
सबसे अधिक इस्तेमाल किया mitochondrial झिल्ली संभावित रंगों के अलावा, TMRM कम से कम mitochondrial विषाक्तता दर्शाती 3 इसलिए, हम इन जीना सेल इमेजिंग अध्ययन के लिए TMRM का चयन करें.
- DMSO और दुकान में -20 डिग्री सेल्सियस पर एक 40 मिमी शेयर TMRM समाधान तैयार एनआईटी एक सेल एक संस्कृति के लिए सभी की खुराक के साथ नए सिरे से फिनोल लाल मुक्त DMEM में काम कर समाधान [25 एनएम ] बनाओ.
- 37 में TMRM 30 मिनट के लिए 25 एनएम के साथ लक्ष्य एनआईटी 1 कोशिकाओं दाग डिग्री सेल्सियस
- ताजा 5 एनएम डाई 4 के संतुलन वितरण को बनाए रखने के लिए TMRM युक्त मीडिया के साथ मीडिया को बदलें.
- एक hematocytometer का उपयोग कर सक्रिय effector AI4 टी कोशिकाओं की गिनती.
- 1 μl / एमएल Picogreen के लिए के साथ सक्रिय effector AI4 टी कोशिकाओं दागकमरे के तापमान पर 5 मिनट और phenol लाल मुक्त संस्कृति के माध्यम 3 बार के साथ धोने.
5. मूल्यांकन टी लिम्फोसाइट की मध्यस्थता बीटा सेल सेल रहते इमेजिंग का उपयोग कर मौत
- एक Zeiss LSM 510 confocal खुर्दबीन के मंच पर दाग एनआईटी कोशिकाओं के साथ माउंट संभाग coverglass. Etheline ऑक्साइड के साथ एक dremmel और गैस संभाग कांच बाँझ के साथ टैब निकालें. इस चरण इमेजिंग रहते सेल कक्ष है कि 37 में नियंत्रित तापमान डिग्री सेल्सियस और 5% नमी के साथ सीओ 2. के साथ सुसज्जित है
- सक्रिय जोड़ें और दाग अलग ई पर नामित कक्षों के लिए टी कोशिकाओं: टी अनुपात.
- नियंत्रण कक्ष में दाग Jurkat कोशिकाओं के एक ही नंबर जोड़ा गया.
6. रहते सेल छवियों को प्राप्त करने
खुर्दबीन एक motorized मंच है कि हमें बार - बार अलग - अलग स्थानों पर प्रयोग के समय के पाठ्यक्रम पर एक ही या अलग स्वचालित रूप से कक्षों से छवियों को प्राप्त अनुमति के साथ सुसज्जित है.
- एक 63x तेल उद्देश्य लेंस का प्रयोग, स्थान प्रति 300 फ्रेम के एक कुल के लिए हर 3 मिनट के अंतराल पर चित्र लेने के.
- TMRM उत्सर्जन 565-619 एनएम के लिए 543 एनएम के एक उत्तेजना तरंग लंबाई और फिल्टर सेट का उपयोग कर धुंधला पता लगाएँ
- Picogreen धुंधला हो जाना एक उत्तेजना 488 एनएम और उत्सर्जन 500-630 एनएम के लिए एक फिल्टर सेट का उपयोग कर पता लगाएँ. वीडियो Zeiss LSM सॉफ्टवेयर का उपयोग कर बनाया गया था.
7. प्रकाशन के लिए वीडियो रूपांतरण
- Zeiss LSM सॉफ्टवेयर का उपयोग, एक AVI प्रारूप में एक असम्पीडित फिल्म फ़ाइल बनाएँ.
- प्रकाशित प्रारूप में वीडियो परिवर्तित करने के लिए, सॉफ्टवेयर पैकेज (फिजी में वीडियो आयात http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji), एक ( ImageJ http://rsb.info. nih.gov / / ij ) वितरण, loci (Bioformats प्लगइन का उपयोग कर http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- चमक और विपरीत सेटिंग्स समायोजित करने के लिए हरे और लाल संकेतों और फ्रेम दर 2 / दूसरे फ्रेम एनीमेशन विकल्प मेनू का उपयोग करने के लिए स्थापित किया गया था संतुलन.
- फसल 512 x 512 पिक्सल और निर्यात एक असम्पीडित AVI फ़ाइल के रूप में करने के लिए वीडियो.
- सॉफ्टवेयर 7 क्विकटाइम (एप्पल कंप्यूटर, Cupertino, CA) में इस AVI फ़ाइल खोलें और सेक और 1200 केबीएस / दूसरा में खुला वीडियो फ़ाइल स्वरूप H264/MPEG-4 में निर्यात.
8. प्रतिनिधि परिणाम:
- 51 करोड़ CML परख का एक प्रतिनिधि परिणाम. टारगेट अनुपात बढ़ जाती है (एक्स अक्ष): चित्रा 1 एक CML परख जहां प्रतिशत विशिष्ट lysis (y अक्ष) effector के रूप में बढ़ जाती है के एक प्रतिनिधि के परिणाम से पता चलता है. लक्ष्य कोशिकाओं प्राथमिक immunodeficient इशारा से अलग islets हैं Rag1-/ - चूहों और 51 करोड़ के साथ लेबल है. . Splenocytes NOD.AI4α / β ट्रांसजेनिक चूहों से अलग कर रहे हैं और ऊपर चरण 2 में वर्णित के रूप में सक्रिय. 16 घंटे के लिए लक्ष्य और effectors सह सुसंस्कृत थे. प्रतिशत विशिष्ट lysis 3.11 ऊपर कदम में वर्णित के रूप में गणना की है.
- एक टी सेल की मध्यस्थता बीटा सेल mitochondrial झिल्ली संभावित अपव्यय के दो प्रतिनिधि परिणाम (सकारात्मक और नकारात्मक) प्रस्तुत कर रहे हैं. कक्ष दाग रहे हैं और प्रतिक्रियाओं दर्ज कर रहे हैं के रूप में 4 कदम, 5 और 6 ऊपर में वर्णित है, चरण 7 में वीडियो फ़ाइलों के रूप में बनाया जाता है. वीडियो 1: माउस बीटा सेल लाइन एनआईटी 1-mitochondrial झिल्ली संभावित डाई TMRM (लाल) दाग था. टी अनुपात 50:1 के: सक्रिय, autoreactive CD8 + टी सेल AI4 (Picogreen साथ सना हुआ हरे रंग) को एक ई सह इन एनआईटी-1 कोशिकाओं के साथ सुसंस्कृत . एनआईटी 1 mitochondrial झिल्ली क्षमता एक 400 मिनट की अवधि के दौरान धीरे - धीरे छितराया हुआ है, लेकिन केवल समूहों कि AI4 टी कोशिकाओं के साथ बातचीत कर रहे थे. वीडियो 2: प्रयोग के रूप में एक नियंत्रण, एनआईटी 1 कोशिकाओं TMRM और Picogreen एक ई पर दाग Jurkat कोशिकाओं के साथ सह - सुसंस्कृत के साथ दाग थे: टी 50:1 के अनुपात. Jurkat कोशिकाओं एक मानव टी सेल लाइन है कि बेमेल MHC है. एनआईटी 1 कोशिकाओं mitochondrial झिल्ली 400 मिनट सह ऊष्मायन अवधि की पूरी अवधि के दौरान संभावित बनाए रखा. Jurkat कोशिकाओं एनआईटी-1 समूहों के साथ बातचीत नहीं था और इसलिए, हत्या प्रेरित नहीं करते.
चित्रा 1 CML के प्रतिनिधि परिणाम लक्ष्य कोशिकाओं प्राथमिक immunodeficient NOD.Rag1 / से अलग islets के रूप में उपयोग कर - NOD.AI4α / β ट्रांसजेनिक चूहों और चूहों से splenocytes. 16 घंटे के लिए लक्ष्य और effectors सह सुसंस्कृत थे. प्रतिशत विशिष्ट lysis effector के रूप में बढ़ जाती है: लक्ष्य अनुपात बढ़ जाती है.
वीडियो 1. माउस बीटा सेल लाइन एनआईटी 1-mitochondrial झिल्ली संभावित डाई TMRM (लाल) दाग था. सक्रिय autoreactive CD8 + टी AI4 कक्ष (Picogreen साथ सना हुआ हरे रंग) इन एनआईटी 1-ई पर कोशिकाओं के साथ सह सुसंस्कृत: टी अनुपात 50:1 का . एनआईटी 1 mitochondrial झिल्ली संभावित dissipaटेड धीरे - धीरे एक 400 मिनट की अवधि के दौरान, लेकिन केवल समूहों है कि हरे AI4 टी कोशिकाओं के साथ बातचीत कर रहे थे. यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने.
वीडियो 2 एनआईटी-1 कोशिकाओं को एक ही दाग 1 वीडियो और Picogreen दाग मानव टी सेल लाइन Jurkat के साथ सह - सुसंस्कृत में वर्णित के रूप में थे. एनआईटी एक - कोशिकाओं के लिए 400 मिनट की अवधि सोचा mitochondrial झिल्ली क्षमता बनाए रखने में सक्षम थे. Jurkat कोशिकाओं एनआईटी-1 समूहों के साथ बातचीत नहीं था और इसलिए हत्या प्रेरित नहीं करते. लिए यहाँ क्लिक करें वीडियो देखने .
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Discussion
साइटोटोक्सिक टी सेल की मध्यस्थता बीटा कोशिका मृत्यु 5 T1D के मुख्य pathophysiology है. CML के 51 करोड़ रिलीज का उपयोग assays हमें effector लक्ष्य 6 प्रतिक्रिया की डिग्री का अध्ययन करने के लिए अनुमति देते हैं. हालांकि, विस्तृत प्रक्रिया और टी बीटा सेल की मध्यस्थता कोशिका मृत्यु के रास्ते अभी भी समझ नहीं है पूरी तरह. चूंकि mitochondria बीटा सेल समारोह और 7 मौत के लिए महत्वपूर्ण हैं, हम दृश्य CML के दौरान mitochondrial परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित . Mitochondrial झिल्ली संभावित अपव्यय mitochondrial कार्यात्मक 8 apoptosis के प्रमुख परिवर्तन के दौरान एक प्रारंभिक और अपरिवर्तनीय कदम है. Confocal माइक्रोस्कोपी जीना सेल इमेजिंग का प्रयोग, हम autoreactive टी lymphocytes के साथ बातचीत के दौरान बीटा सेल mitochondrial झिल्ली संभावित अपव्यय कल्पना करने में सक्षम थे. इस प्रयोगात्मक सेटिंग T1D के विकास के दौरान बीटा कोशिकाओं को होता है कम से कम हिस्सा mimics. इस प्रयोग की सीमाएं शामिल हैं: हमारे Zeiss माइक्रोस्कोप के साथ सुसज्जित रहते सेल इमेजिंग के लिए हीटिंग डालने 3.5 सेमी पेट्री डिश के लिए डिजाइन किया गया था, इसलिए जब 8 अच्छी तरह से उपयोग लैब तक द्वितीय संभाग coverglass (एक साथ इलाज की रिकॉर्डिंग और नियंत्रण के लिए), संभाल संभाग coverglass पर करने के क्रम में खुर्दबीन डालने में फिट हटा दिया जाना चाहिए. इसके अलावा, क्योंकि हीटिंग डालने के एक 35 मिमी पेट्री डिश के लिए डिज़ाइन किया गया है जब हम 8 अच्छी तरह लैब तक द्वितीय संभाग coverglass का उपयोग करें, हम केंद्र 4 कुओं के लिए ही सीमित थे. इस सीमा को आसानी से एक हीटिंग विशेष रूप से Zeiss द्वारा लैब तक द्वितीय संभाग coverglass के लिए तैयार डालने की स्थापना द्वारा हल किया जा सकता है. आनुवंशिक फ्लोरोसेंट effector टी कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए लक्ष्य कोशिकाओं पर हमला, या साइटोकिन्स या सेल सेल बातचीत के संकेत दे रास्ते के परीक्षण सहित इस प्रयोग के संभावित संशोधनों. T1D के रोगजनन में बीटा कोशिका मृत्यु एक जटिल प्रक्रिया है, सहित कई रास्ते शामिल है, लेकिन सीमित Granzyme और perforin 9, 9 / फैस फैस ligand, साइटोकिन्स 10 नहीं. Caspases और granzyme उपलब्ध बी वाणिज्यिक के लिए फ्लोरोसेंट substrates रहे हैं, इन विकल्पों के साथ रास्ते और बीटा कोशिका मृत्यु के दौरान की घटनाओं के अनुक्रम का अध्ययन करने के लिए संभव है.
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Disclosures
जानवरों पर प्रयोग फ्लोरिडा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति विश्वविद्यालय द्वारा निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
Acknowledgments
इस काम DK074656 स्वास्थ्य और AI56374 (CEM) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किशोर मधुमेह अनुसंधान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
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- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
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- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
