Summary

Methoden zur Beta Cell Death vermittelt durch zytotoxische T-Lymphozyten Beurteilung

Published: June 16, 2011
doi:

Summary

Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays können verwendet werden, um autoreaktive Reaktionen und Studium Mechanismen des Zelltods in vitro zu testen. Allerdings kann die Verwendung lebender Zellen konfokale mikroskopische Bildgebung mit Fluoreszenzfarbstoffen, die Art und Kinetik der Zelltod als auch die Wege genutzt näher untersucht werden.

Abstract

Typ 1 Diabetes (T1D) ist eine T-Zell-vermittelten Autoimmunerkrankungen. Während der Pathogenese, werden Patienten zunehmend insulinopenic als Insulin-Produktion ist verloren, vermutlich Dies ergibt sich aus der Zerstörung der Betazellen des Pankreas durch T-Zellen. Das Verständnis der Mechanismen der Beta-Zell Tod während der Entwicklung von T1D liefert Einblicke in ein wirksames Heilmittel für diese Krankheit zu erzeugen. Zell-vermittelten Lymphozytotoxizität (CML)-Assays haben in der Vergangenheit das Radionuklid Chromium 51 (51 Cr) verwendet werden, um Zielzellen Etikett. Diese Ziele werden dann zu Effektor-Zellen ausgesetzt und die Freisetzung von 51 Cr von Zielzellen ist als ein Hinweis auf Lymphozyten-vermittelten Zelltod zu lesen. Inhibitoren der Zelltod führen zu einer verminderten Freisetzung von 51 Cr.

Als Effektorzellen, haben wir eine aktivierte autoreaktive klonale Population von CD8 + zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) aus einer Maus Lager transgenen sowohl für die alpha-und beta-Ketten des AI4 T-Zell-Rezeptor (TCR) isoliert. Aktiviert AI4 T-Zellen wurden mit 51 Cr markierten Target NIT-Zellen für 16 Stunden ko-kultiviert, die Freisetzung von 51 Cr wurde aufgezeichnet, um spezifische Lyse berechnet

Mitochondrien in vielen wichtigen physiologischen Ereignisse, wie die Energieproduktion, die Regulierung der Signalweiterleitung und Apoptose beteiligt. Das Studium der Beta-Zell-Mitochondrien funktionelle Veränderungen bei der Entwicklung von T1D ist ein neuartiges Gebiet der Forschung. Mit der mitochondrialen Membranpotentials Farbstoff Tetramethylrhodamin Methyl Ester (TMRM) und konfokale Mikroskop live cell imaging, verfolgten wir Mitochondrienmembranpotential im Laufe der Zeit in der Beta-Zell-Linie NIT-1. Für die Bildgebung Studien wurden Effektor AI4 T-Zellen mit dem fluoreszierenden Farbstoff Kernfärbung PicoGreen gekennzeichnet. NIT-1-Zellen und T-Zellen wurden in Kammern Deckglas co-kultiviert und montiert auf dem Mikroskoptisch mit einer lebenden Zelle Kammer ausgestattet, kontrolliert bei 37 ° C, mit 5% CO 2, und befeuchtet. Bei diesen Experimenten Bilder wurden von jedem Cluster alle 3 Minuten für 400 Minuten gedauert.

Über einen Zeitraum von 400 Minuten, beobachteten wir die Ableitung der mitochondrialen Membranpotentials in NIT-1-Zell-Cluster, wo AI4 T-Zellen wurden angebracht. In der gleichzeitigen Steuerung Experiment, bei dem NIT-1-Zellen mit MHC wurden co-kultivierten mis-abgestimmt menschliche Lymphozyten Jurkat-Zellen, blieb Mitochondrienmembranpotential intakt. Diese Technik kann verwendet werden, um Änderungen in Echtzeit in mitochondrialen Membranpotentials in Zellen unter Beschuss von zytotoxischen Lymphozyten, Zytokinen oder anderen zytotoxischen Reagenzien zu beobachten.

Protocol

1. Vorbereitung der Zellen Ziel der Zellkultur: Kultur der Maus Beta-Zell-Linien, NIT-1 und NIT-4 wurde ein zuvor beschriebenen 1,2 in DMEM mit 10% FBS, 0,02% BSA, Non-essentielle Aminosäure, 15 mM HEPES, 16.5mm ergänzt Glocose und Penicillin / Streptomycin. Für 51 Cr Kennzeichnung, Samenzellen in einem flachem Boden 96-well-Kulturplatte bei 5×10 4 Zellen / well in 200 ul Kulturmedium. Für die Mikroskopie Experimente Samenzellen in einem 8-well Lab-Tak II chambered Deckgla…

Discussion

Zytotoxische T-Zell-vermittelten beta Zelltod ist die wichtigste Pathophysiologie der T1D 5. CML-Assays mit 51 Cr Freisetzung ermöglichen es uns, den Grad der Effektor-Target-Reaktion 6 Studie. Allerdings ist der detaillierte Prozess und Wege der T-Zell-vermittelten Zelltod beta noch nicht vollständig verstanden. Da Mitochondrien entscheidend für Beta-Zell-Funktion und der Tod 7 sind, konzentrierten wir uns auf die mitochondriale Veränderungen während der visuellen CML. M…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health DK074656 und AI56374 (CEM), sowie die Juvenile Diabetes Research Foundation unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Cr-51 Perkin Elmer NEZ030500IMC  
PBS Cellgro 21-040-60  
Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) Invitrogen T668  
Picogreen Invitrogen P7581  
AI4 mimotope mimotopes.com amino acid sequence: YFIENYLEL  
IL-2 R & D 485-MI  
DMEM Invitrogen 11885  
FBS HyClone SH30071.03  
Bovine Serum Albumin Sigma A8412  
HEPES Cellgro 25-060-Cl  
MEM Non-Essential Amino Acids GIBCO 11140  
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109  
Phenol red-free DMEM Sigma D5303  
CO2 Incubator Thermo Fisher HeraCell 150i Kept sterile for cell culture
Biological safety cabinet Thermo Fisher Forma 1440  
Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass Fisher 14-958-A  
Gamma Counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta Confocal With motorized stage and live cell chamber
Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) Eppendorf    
Tubes (Amber) Fisher 50819772  
Centrifuge Sorvall Legend RT+ 75004377  
Hemacytometer Fisher Scientific 267110  
Upright Microscope Zeiss Axioskop40  
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice The Jackson Laboratory 004347  
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice The Jackson Laboratory 004348  
NOD-AI4α/ β F1 mice N/A N/A Bred in UF animal facility

References

  1. Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
  2. Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
  3. Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
  4. Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
  5. Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
  6. Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
  7. Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
  8. Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
  9. Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
  10. Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).

Play Video

Cite This Article
Chen, J., Grieshaber, S., Mathews, C. E. Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (52), e2724, doi:10.3791/2724 (2011).

View Video