Summary

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Published: June 16, 2011
doi:

Summary

셀 – 중재의 lymphocytotoxicity (CML) assays는 체외에서 autoreactive 반응 및 세포 사망의 학습 메커니즘을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 형광 염료, 타입 및 세포 죽음뿐만 아니라 활용 경로의 반응 속도론 살 세포 공촛점 미세한 이미징 기술을 사용하여 더 자세히 공부하실 수 있습니다.

Abstract

제 1 형 당뇨병 (T1D)는 T 세포 매개 면역 질환이다. 인슐린 생산이 분실로 pathogenesis 동안, 환자는 T 세포에 의해 췌장 베타 세포의 파괴에서 아마도이 결과는 점차적으로 더 insulinopenic됩니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 죽음의 메커니즘을 이해하는 것은이 질병에 대한 효과적인 치료를 생성하는 통찰력을 제공할 것입니다. 셀 – 중재 lymphocytotoxicity (CML) assays는 역사적으로 대상 세포를 레이블 radionuclide 크롬 51 (51 CR) 사용하고 있습니다. 이러한 목표는 다음 효과기 세포에 노출되고 대상 세포에서 51 피크의 릴리스는 림프구 – 중재 세포의 죽음은 표시대로 읽습니다. 51 피크의 감소 릴리스에서 세포 사망 결과의 억제제.

효과기 세포, 우리는 CD8의 활성화 autoreactive clonal 인구 + 알파 및 AI4 T 세포 수용체 (TCR)의 베타 체인 모두에 대해 마우스 재고 유전자 변형으로부터 격리 세포 독성 T의 lymphocytes (CTL)을 사용합니다. 활성 AI4 T 세포는 16 시간 동안 51 피크 표시 대상 NIT 세포와 공동 교양 있었다, 51 릴리스는 피크는 특정 용해를 계산하기 위해 기록된

Mitochondria 같은 에너지 생산, 전달 시그널링 규제 및 apoptosis 등 많은 중요한 생리 이벤트에 참여할 수 있습니다. T1D의 개발 기간 동안 베타 세포 mitochondrial 기능 변화의 연구는 연구의 소설 공간입니다. mitochondrial 막 잠재적인 염료 Rhodamine Tetramethyl 메틸 에스테르 (TMRM)와 공촛점 미세한 라이브 셀 이미징을 사용하여, 우리는 베타 세포 라인 NIT – 1에서 시간이 지남에 따라 mitochondrial 막 잠재력을 감시. 이미징 연구, 효과기 AI4 T 세포는 형광 염색법 핵 염색 Picogreen으로 표시되었습니다. NIT – 1 세포와 T 세포가 chambered coverglass 공동 교양과 라이브 셀 챔버가 장착된 현미경 무대에 장착된 37에 지배되었다 ° C 5 % CO 2, humidified와 함께. 이러한 실험을하는 동안 이미지는 각 클러스터의 400 분 동안 매 3 분 촬영했다.

400분의 과정 동안, 우리는 AI4 T 세포가 첨부되었습니다 NIT – 1 셀 클러스터의 mitochondrial 막 잠재력의 낭비를 관찰했다. NIT – 1 세포가 MHC와 함께 공동 교양 있던 동시 제어 실험에 잘못이 검색 인간 림프구 Jurkat 세포를 mitochondrial 멤브레인 가능성은 온전하게 남아 있어요. 이 기술은 세포 독성 lymphocytes, 크린 시토킨 또는 다른 세포 독성 시약의 공격을 받고 세포 mitochondrial 막 잠재력에 실시간으로 변경 사항을 관찰하는 데 사용할 수 있습니다.

Protocol

1. 세포의 준비 대상 세포 배양 : 마우스 베타 세포 라인, NIT – 1 NIT – 4의 문화는 10 % FBS, 0.02 %의 BSA, 비 필수 아미노산, 15mM HEPES, 16.5mM와 보충 DMEM에서 이전에 설명한 1,2되었습니다 Glocose 및 페니실린 / 스트렙토 마이신. 5X10 4 세포에서 평면 바닥 96 – 웰 문화 플레이트에 51 피크 라벨, 종자 세포 / 음 200 μl 문화 매체하십시오. 에 대한 현미경 실험, 500 μl 문화 매체 챔버 …

Discussion

세포 독성 T 세포 매개 베타 세포 죽음은 T1D 5 주 pathophysiology입니다. 51 피크 자료를 사용하여 CML의 assays은 우리가 효과기 – 목표 응답 6 정도를 공부하실 수 있습니다. 그러나, 세부적인 프로세스 및 T 세포 – 매개 베타 세포 사망 경로는 아직도 완전히 이해되지 않습니다. mitochondria가 베타 세포 기능과 사망 7 중요하기 ​​때문에, 우리는 시각 CML 동안 mitochondrial 변?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 건강 DK074656 및 AI56374 (CEM)의 국립 연구소에서 보조금뿐만 아니라, 소아 당뇨병 연구 재단에 의해 지원되었다.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Cr-51 Perkin Elmer NEZ030500IMC  
PBS Cellgro 21-040-60  
Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) Invitrogen T668  
Picogreen Invitrogen P7581  
AI4 mimotope mimotopes.com amino acid sequence: YFIENYLEL  
IL-2 R & D 485-MI  
DMEM Invitrogen 11885  
FBS HyClone SH30071.03  
Bovine Serum Albumin Sigma A8412  
HEPES Cellgro 25-060-Cl  
MEM Non-Essential Amino Acids GIBCO 11140  
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109  
Phenol red-free DMEM Sigma D5303  
CO2 Incubator Thermo Fisher HeraCell 150i Kept sterile for cell culture
Biological safety cabinet Thermo Fisher Forma 1440  
Disposable culture tubes, 6×50 mm Lime Glass Fisher 14-958-A  
Gamma Counter Perkin Elmer Wizard 1470 Automatic Gamma Counter  
Confocal microscope Zeiss LSM 510 Meta Confocal With motorized stage and live cell chamber
Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) Eppendorf    
Tubes (Amber) Fisher 50819772  
Centrifuge Sorvall Legend RT+ 75004377  
Hemacytometer Fisher Scientific 267110  
Upright Microscope Zeiss Axioskop40  
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice The Jackson Laboratory 004347  
NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice The Jackson Laboratory 004348  
NOD-AI4α/ β F1 mice N/A N/A Bred in UF animal facility

References

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Cite This Article
Chen, J., Grieshaber, S., Mathews, C. E. Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes. J. Vis. Exp. (52), e2724, doi:10.3791/2724 (2011).

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