Summary
Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.
Abstract
סוכרת מסוג 1 (T1D) הוא תא T בתיווך מחלה אוטואימונית. במהלך בפתוגנזה, חולים הופכים בהדרגה insulinopenic יותר כמו ייצור אינסולין הוא איבד, ככל הנראה זו תוצאה של הרס תאים בטא בלבלב על ידי ותאי T. הבנת מנגנוני מוות של תאים בטא במהלך הפיתוח של T1D יספק תובנות כדי ליצור תרופה יעילה למחלה זו. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity השתמשו בעבר כרום רדיונוקלידים 51 (51 Cr) לתייג התאים היעד. מטרות אלו נחשפים מכן מפעיל תאים ושחרור של 51 Cr מתאי המטרה היא לקרוא כאינדיקציה המוות הלימפוציטים בתיווך התא. מעכבי תוצאה של התא למוות לשחרר ירידה של 51 Cr.
כמו תאים מפעיל, השתמשנו האוכלוסייה מופעל המשובטים autoreactive של CD8 + ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) מבודד מהונדס עכבר המניות אלפא וגם שרשראות בטא של קולטן T AI4 תא (TCR). הופעל AI4 בתאי T היו שיתוף תרבותי עם 51 Cr שכותרתו ניט תאים היעד במשך 16 שעות, שחרור של 51 Cr נרשמה לחשב תמוגה ספציפי
המיטוכונדריה להשתתף באירועים רבים פיזיולוגיים חשובים כגון הפקת אנרגיה, ויסות איתות התמרה, ו אפופטוזיס. המחקר של בטא שינויים התא המיטוכונדריה תפקודית במהלך הפיתוח של T1D הוא אזור הרומן של המחקר. שימוש המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה לצבוע Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) הדמיה confocal מיקרוסקופיים תא חי, אנחנו במעקב פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לאורך זמן בתור תא בטא ניט-1. עבור בדיקות הדמיה, מפעיל AI4 בתאי T תויגו עם פלורסנט גרעיני מכתים צבע Picogreen. ניט-1 ותאי T היו שיתוף בתרבית החדרים coverglass ועלה על הבמה מיקרוסקופ המצויד בתא תא חי, מבוקר על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, ו humidified. במהלך ניסויים אלה התמונות נלקחו של כל אשכול כל 3 דקות עבור 400 דקות.
במהלך של 400 דקות, צפינו את פיזור פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ניט-1 אשכולות התא שבו AI4 בתאי T צורפו. בניסוי שליטה בו זמנית איפה ניט-1 התאים היו שיתוף תרבותי עם MHC אי - התאמה האדם תאים לימפוציטים Jurkat, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה נותרו על כנן. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לצפות בזמן אמת שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים תחת מתקפה של לימפוציטים, ציטוקינים ציטוטוקסיות, או ריאגנטים ציטוטוקסיות אחרות.
Protocol
1. הכנת התאים
- תא היעד תרבות: תרבות של בטא עכבר שורות תאים, ניט-1 ו אנבה-4, היה 1,2 תיאר בעבר DMEM בתוספת 10% FBS, BSA 0.02%, שאינן חיוניות חומצות אמינו, 15mm HEPES, 16.5mM Glocose ו פניצילין / סטרפטומיצין. במשך 51 תיוג Cr, בתאי הזרע צלחת שטוחה לתחתית-96 גם בתרבות ב 5X10 4 תאים / טוב בינוני 200 μl תרבות. עבור מיקרוסקופיה ניסויים בתאי הזרע 8-היטב Lab-טאק II החדרים coverglass ב 5x10 4 לכל תא בינוני 500 μl תרבות, ולאפשר לגדול במשך 48 שעות לפני השימוש בניסויים cytotoxicity.
- בקרת קו T תרבית תאים: השתמש שורת תאים Jurkat (ATCC, CD3 + תא אנושי קו לימפוציטים) כביקורת שלילית. Jurkat התרבות תאים RPMI1640 בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1.5 גר '/ L סודיום ביקרבונט, HEPES 10 מ"מ 1.0 נתרן pyruvate מ"מ.
2. אוסף והפעלה של מפעיל autoreactive CD8 + T תאים
NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] ו NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] נרכשו מן המעבדה ג'קסון (בר הרבור, ME) ו העכבר הוליד במתקן שלנו. הצאצאים היברידית F1 מ הזדווגויות של NOD-AI4a עם NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] לפתח סוכרת ב 3-5 שבועות. כל העכברים שוכנו הפתוגן ללא מתקנים ספציפיים שאושרו על ידי טיפול בבעלי חיים של מוסד רלוונטי ועדת שימוש.
- להרדים 3-4 בן שבוע NOD-AI4a / b בעכברים באמצעות ה-CO 2.
- איסוף spleens מעכברים. בעכברים מורדמים מוכנים עם תרסיס אתנול ופתח מתחת למכסה המנוע כירורגית. Spleens יוסרו לשים חיץ קרים כקרח HBSS מיד.
- איסוף תאים הטחול באמצעות 7 מ"ל זכוכית homogenizer. שניים עד שלושה spleens כל שמים 5 מ"ל של HBSS קר הומוגני עם 7 מ"ל זכוכית homogenizer. Homogenate נאסף centrifuged ב 1200rpm במשך 5 דקות ב 4 ° C באמצעות צנטריפוגות Sorvall RT7 +. כדורי תא נאספים.
- הסר את כדוריות הדם האדומות באמצעות טיפול פתרון hypotonic. פתיתי מטופלים עם 5 מ"ל hypotonic פתרון / הטחול על קרח למשך 5 דקות, ואז לנטרל על ידי הוספת נפח שווה של HBSS. איסוף תאים על ידי צנטריפוגה, כאמור לעיל, ו resuspend ב 50 HBSS מ"ל. Pass התאים מושעה דרך מסננת התא לספור באמצעות hemocytometer עם מכתים TrypanBlue.
- הפעלת התאים. תאים Resuspend ב 5x10 6 / mL ולהפעיל באמצעות התרבות 3 יום עם 0.1 מיקרומטר AI4 mimotope (רצף החומצות האמיניות YFIENYLEL) ו 25 U / mL IL-2 ב RPMI1640 בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-גלוטמין, 1.5 גר '/ L סודיום ביקרבונט, HEPES 10 מ"מ 1.0 נתרן pyruvate מ"מ.
3. Assay 51 Cr לשחרר לבחון CML
- היעד תאים לייבל: הוסף 51 Cr למקד תאים ב 1 μCi / היטב בתרבות במשך 3 שעות, 3 פעמים ולשטוף עם המדיום לתרבות.
- להשעות מפעיל תאים במדיום 1640 RPMI כאמור בשלב 2.5 כך הנפח הסופי נוספו גם כל 200 μl.
- לאחר לשטוף הסופי של התאים היעד שכותרתו, להוסיף תאים מפעיל מופעל על התא תרבויות היעד ב מפעיל הרצוי היעד (E: T) יחסי. אנחנו בדרך כלל להשתמש E: יחסי T על 0.4:1, 01:01, 02:01, 05:01, 10:01, 20:01 ו - 50:1.
- הוסף טרי שונה RPMI 1640 בינוני (ראה שלב 2.5) עד 6 בארות של תאים מטרה לשמש שליטה תמוגה ספונטנית.
- שיתוף התרבות תאים מפעיל היעד במשך 16 שעות.
- איסוף supernatant ב 6x50 מ"מ צינורות זכוכית ליים
- Lyse תאים על ידי הוספת SDS 2% 100μl ו pipetting מספר פעמים בעדינות.
- איסוף lysate תא קבוצה נוספת של 6x50 מ"מ ליים צינורות זכוכית.
- לשטוף בארות פעם עם נקי H 2 O ולהוסיף את לשטוף את הצינורות lysate התא.
- הרוזן supernatants ו lysates תא באמצעות מונה גמא.
- חישוב תמוגה ספציפיים כדלקמן:
4. מכתים של תאים עבור דימות תא חי
בין הנפוצות ביותר צבעים קרום המיטוכונדריה פוטנציאל, תערוכות TMRM את הרעילות לפחות המיטוכונדריה. 3 לפיכך, אנו בוחרים TMRM אלה בדיקות הדמיה לחיות התא.
- הכן 40 המניות mM פתרון TMRM ב DMSO ולאחסן ב -20 ° C. הפוך [25 nM] פתרון עובד טרי פנול אדום ללא DMEM עם כל תוספי לתרבות ניט 1 תא 1.
- הכתם היעד ניט-1 תאים עם TMRM 25 ננומטר למשך 30 דקות ב 37 ° C.
- החלף את התקשורת עם התקשורת טרי המכיל 5 nM TMRM לשמור על חלוקת משקל של 4 צבע.
- הרוזן מופעל מפעיל AI4 בתאי T באמצעות hematocytometer.
- הכתם מופעל מפעיל AI4 בתאי T עם μl 1 / mL Picogreen עבור5 דקות בטמפרטורת החדר לשטוף עם פנול אדום ללא בינוני תרבות 3 פעמים.
5. הערכת תא T לימפוציטים בתיווך מוות בטא באמצעות דימות תא חי
- הר coverglass החדרים עם תאים ניט מוכתם על הבמה של מיקרוסקופ LSM 510 Zeiss confocal. הסר את הכרטיסייה עם dremmel וגז לעקר את הכוס החדרים עם תחמוצת etheline. השלב מצויד תא חי תא הדמיה כי יש טמפרטורה מבוקרת על 37 ° C ו 5% CO 2 עם לחות.
- הוסף מופעל בתאי T מוכתמות לתאי המיועד ב E שונים: יחסי טי.
- נוסף אותו מספר של תאים Jurkat מוכתם לתאי הבקרה.
6. קבלת תמונות תא חי
המיקרוסקופ מצויד הבמה ממונע שאפשר לנו שוב ושוב לרכוש תמונות במקומות שונים מתאי זהה או שונה באופן אוטומטי במשך זמן הניסוי.
- באמצעות עדשה שמן 63x אובייקטיבי, לקחת תמונות בהפרש של כל 3 דקות עבור סכום כולל של 300 מסגרות לשנייה מיקום.
- זיהוי מכתים TMRM באמצעות גל עירור באורך של 543 ננומטר להגדיר מסנן פליטה 565-619 ננומטר
- זיהוי מכתים Picogreen באמצעות עירור 488 ננומטר ומערכת סינון עבור פליטת 500-630 ננומטר. הסרטון נוצר באמצעות תוכנה Zeiss LSM.
7. וידאו המרה לפרסום
- שימוש בתוכנה LSM Zeiss, ליצור קובץ דחוס סרט בפורמט AVI.
- כדי להמיר את הוידאו לפורמט שפורסם, לייבא את הווידאו לתוך חבילת תוכנה פיג'י ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) הפצה, באמצעות תוסף Bioformats מ לוקוסים ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- התאם את הגדרות הבהירות והניגודיות כדי לאזן את אותות ירוק ואדום ואת מסגרת הדולר נקבע 2 מסגרות / שנייה באמצעות תפריט אפשרויות אנימציה.
- לחתוך את הווידאו 512 x 512 פיקסלים ולייצא כקובץ לא דחוס אבי.
- פתח קובץ AVI ב Quicktime תוכנה 7 (Apple Computer, בקופרטינו, קליפורניה) ו לדחוס ולייצא את פורמט קובץ פתוח וידאו H264/MPEG-4 ב 1200 kbs / שנייה.
8. נציג תוצאות:
- התוצאה נציג assay 51 CML Cr. איור 1 מציג תוצאה נציג assay CML שם תמוגה אחוז מסוים (ציר Y) מגדילה את מפעיל: יחס יעד (ציר X) עולה. תאים היעד העיקרי הם איים מבודדים NOD immunodeficient Rag1-/ -. עכברים שכותרתו עם 51 Cr. Splenocytes מן העכברים הטרנסגניים NOD.AI4α / β מבודדות הופעל כמתואר בשלב 2 לעיל. מטרות effectors היו שיתוף תרבותי במשך 16 שעות. תמוגה אחוז מסוים מחושב כמתואר צעד 3.11 לעיל.
- שני (חיוביות ושליליות) נציג תוצאות של תא בתיווך T בטא פיזור קרום התא המיטוכונדריה פוטנציאל מוצגים. תאים הם מוכתמים ותגובות נרשמות כמתואר 4 שלבים, 5 ו -6 לעיל, קבצי וידאו נוצרים כמו בשלב 7. וידאו 1: בטא עכבר התא קו ניט-1 היה מוכתם פוטנציאל קרום המיטוכונדריה TMRM צבע (אדום). הופעל, autoreactive CD8 + T התא AI4 (ירוק ויטראז עם Picogreen) היו שיתוף תרבותי עם אלה ניט-1 תאים ב E: T יחס של 50:1. ניט-1 פוטנציאל קרום המיטוכונדריה התפוגגה בהדרגה במהלך משך 400 דקות, אבל רק אשכולות שהיו באינטראקציה עם AI4 ותאי T. וידאו 2: כמו בניסוי שליטה, ניט-1 תאים הוכתמו TMRM ושיתוף בתרבית עם תאים Picogreen Jurkat מוכתם ב E: T יחס של 50:1. תאים Jurkat הם קו התא האנושי T כי היא MHC תואמים. ניט-1 התאים נשמר פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה במהלך כל תקופת 400 דקות שיתוף תקופת הדגירה. תאים Jurkat לא אינטראקציה עם ניט-1 אשכולות ולכן, לא לגרום הרג.
איור 1 תוצאה נציג CML כמו איים באמצעות תאים היעד העיקרי שבודד immunodeficient NOD.Rag1-/ -. עכברים splenocytes מן העכברים הטרנסגניים NOD.AI4α / β. מטרות effectors היו שיתוף תרבותי במשך 16 שעות. תמוגה אחוז מסוים מגבירה את מפעיל: יחס מגביר יעד.
1. בטא עכבר וידאו התא קו ניט-1 היה מוכתם הקרום המיטוכונדרי פוטנציאל TMRM צבע (אדום). הופעל autoreactive CD8 + T התא AI4 (ירוק ויטראז עם Picogreen) היו שיתוף תרבותי עם אלה-1 ניט תאים ב E: היחס T של 50:1. ניט-1 המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה dissipaטד בהדרגה במהלך משך 400 דקות, אבל רק אשכולות שהיו באינטראקציה עם ירוק AI4 ותאי T. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
וידאו 2. אנבה-1 התאים היו מוכתמים אותו כמתואר וידאו 1 ושיתוף תרבותי עם Picogreen Jurkat מוכתם האדם קו T התא. ניט-1 התאים היו מסוגלים לשמור על פוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה מחשבה משך 400 דקות. תאים Jurkat לא אינטראקציה עם ניט-1 אשכולות ולכן לא לגרום הרג. לחץ כאן כדי לצפות בווידאו .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ציטוטוקסיות T בטא בתיווך התא מוות של תאים הוא פתופיזיולוגיה העיקרי של T1D 5. מבחני CML באמצעות שחרור 51 Cr לאפשר לנו ללמוד את מידת התגובה היעד מפעיל-6. עם זאת, תהליך מפורט מסלולים המוות T התא בתיווך תא הבטא עדיין לא הבינו באופן מלא. מאז המיטוכונדריה הן קריטיות לתפקוד התא בטא ומוות 7, התמקדנו שינויים המיטוכונדריה במהלך CML חזותית. פיזור מיטוכונדריאלי פוטנציאל הממברנה היא צעד מוקדם ובלתי הפיך במהלך שינויים פונקציונליים המיטוכונדריה המוביל אפופטוזיס 8. באמצעות מיקרוסקופיה confocal לחיות הדמיה התא, הצלחנו לדמיין תא בטא המיטוכונדריה קרום פיזור פוטנציאל במהלך אינטראקציות עם לימפוציטים מסוג T autoreactive. הגדרה זו הניסיוני מחקה לפחות חלק ממה שקורה בתאי ביתא במהלך הפיתוח של T1D. מגבלות הניסוי הזה כוללים: להכניס חימום הדמיה תא חי מצויד מיקרוסקופ Zeiss שלנו תוכנן עבור 3.5 מנות ס"מ פטרי, ולכן בעת שימוש 8-היטב Lab-טאק II החדרים coverglass (עבור מטופלים בו זמנית הקלטה של בקרות), ידית על coverglass החדרים יש להסיר כדי להתאים להכניס את המיקרוסקופ. כמו כן, מכיוון להכניס חימום מיועד צלחת פטרי 35mm, כאשר אנו משתמשים גם 8-Lab-טאק II החדרים coverglass, היינו מוגבלים 4 בארות במרכז. מגבלה זו ניתן לפתור בקלות על ידי התקנה של הכנס חימום תוכנן במיוחד על ידי Zeiss עבור Lab-טאק II החדרים coverglass. שינויים אפשריים של ניסוי זה כולל באמצעות פלורסנט גנטית בתאי T מפעיל לתקוף תאים היעד, או בדיקות במעברי האותות של ציטוקינים או תאים תאים אינטראקציות. מוות של תאים בטא בפתוגנזה של T1D היא תהליך מסובך, כרוך מסלולים כולל אך לא מוגבל, ציטוקינים Granzyme ו perforin 9, פאס / פאס ליגנד 9, 10. ישנם מצעים ניאון עבור caspases ו-B granzyme זמינים מסחרית, עם אפשרויות אלה אפשר ללמוד המסלולים ואת רצף האירועים במהלך מוות של תאים בטא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת פלורידה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות DK074656 ו AI56374 (CEM), כמו גם את הקרן למחקר סוכרת נעורים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
- Lemasters, J. J., Ramshesh, V. K. Imaging of mitochondrial polarization and depolarization with cationic fluorophores. Methods Cell Biol. 80, 283-295 (2007).
- Abel, M., Krokowski, M. Pathophysiology of immune-mediated (type 1) diabetes mellitus: potential for immunotherapy. BioDrugs. 15, 291-301 (2001).
- Mathews, C. E., Graser, R. T., Savinov, A., Serreze, D. V., Leiter, E. H. Unusual resistance of ALR/Lt mouse beta cells to autoimmune destruction: role for beta cell-expressed resistance determinants. Proc Natl Acad Sci U S A. , 235-240 (2001).
- Szabadkai, G., Duchen, M. R. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis. 14, 1405-1423 (2009).
- Ly, J. D., Grubb, D. R., Lawen, A. The mitochondrial membrane potential (deltapsi(m)) in apoptosis; an update. Apoptosis. 8, 115-128 (2003).
- Dudek, N. L. Cytotoxic T-cells from T-cell receptor transgenic NOD8.3 mice destroy beta-cells via the perforin and Fas pathways. Diabetes. 55, 2412-2418 (2006).
- Pakala, S. V., Chivetta, M., Kelly, C. B., Katz, J. D. In autoimmune diabetes the transition from benign to pernicious insulitis requires an islet cell response to tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 189, 1053-1062 (1999).
