Summary
Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.
Abstract
Diabete di tipo 1 (T1D) è una malattia mediata da cellule T autoimmuni. Durante la patogenesi, i pazienti diventano progressivamente più insulinopenic come la produzione di insulina è perso, probabilmente questa è dovuta alla distruzione delle cellule beta pancreatiche da parte delle cellule T. La comprensione dei meccanismi di morte delle cellule beta durante lo sviluppo del diabete di tipo 1 fornirà spunti per generare una cura efficace per questa malattia. Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC), saggi, storicamente, hanno utilizzato il radionuclide cromo 51 (51 Cr) per etichettare le cellule bersaglio. Questi obiettivi sono quindi esposti alle cellule effettrici e il rilascio di 51 Cr da cellule bersaglio viene letto come un'indicazione di mediata dai linfociti morte cellulare. Inibitori di conseguenza la morte cellulare in versione ridotta di 51 Cr.
Come cellule effettrici, abbiamo utilizzato un autoreattivi attivati popolazione clonale di CD8 + linfociti T citotossici (CTL) isolato da un topo transgenico magazzino sia per l'alfa e catene beta del recettore AI4 delle cellule T (TCR). AI4 cellule T attivate sono state co-coltura con 51 cellule bersaglio Cr etichettati NIT per 16 ore, il rilascio di 51 Cr è stato registrato per calcolare lisi specifiche
Mitocondri partecipare a molti eventi fisiologici importanti, come la produzione di energia, regolazione della trasduzione del segnale, e l'apoptosi. Lo studio delle cellule beta cambia mitocondriale funzionale durante lo sviluppo di diabete di tipo 1 è una zona nuova della ricerca. Utilizzando il potenziale di membrana mitocondriale colorante tetrametile rodamina estere metilico (TMRM) e confocale di immagini microscopiche cellule vive, abbiamo monitorato il potenziale della membrana mitocondriale nel corso del tempo nella linea di cellule beta NIT-1. Per gli studi di imaging, le cellule T effettrici AI4 sono stati etichettati con il colorante fluorescente nucleare colorazione PicoGreen. NIT-1 le cellule e le cellule T sono state co-coltura in chambered coprioggetti e montato sul palco microscopio dotato di una camera di cellule vive, controllata a 37 ° C, con il 5% di CO 2, e umidificata. Durante questi esperimenti immagini sono state prese di ogni cluster ogni 3 minuti per 400 minuti.
Più di un corso di 400 minuti, abbiamo osservato la dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale in NIT-1 gruppi di cellule in cui sono state allegate AI4 cellule T. Nell'esperimento controllo simultaneo in cui NIT-1 cellule sono state co-coltura con MHC mis-matched cellule umane Jurkat linfociti, potenziale di membrana mitocondriale è rimasto intatto. Questa tecnica può essere usata per osservare in tempo reale i cambiamenti del potenziale di membrana mitocondriale nelle cellule sotto l'attacco dei linfociti citotossici, citochine o altri reagenti citotossici.
Protocol
1. Preparazione di cellule
- Obiettivo coltura cellulare: Cultura delle linee di cellule beta del mouse, NIT-1 e NIT-4, era un 1,2 precedentemente descritta in DMEM supplementato con 10% FBS, 0,02% BSA, non aminoacidi essenziali, HEPES 15mm, 16,5 mm Glocose e penicillina / streptomicina. Per 51 etichettatura Cr, le cellule di semi in un piatto fondo da 96 pozzetti alla piastra di coltura 5X10 4 cellule / pozzetto in 200 microlitri terreno di coltura. Per gli esperimenti di microscopia, le cellule di semi in un 8-ben Lab-Tak II chambered coprioggetti 5x10 a 4 per camera in 500 microlitri terreno di coltura, e consentono di crescere per 48 ore prima di utilizzare negli esperimenti di citotossicità.
- Controllo di colture cellulari linea T: Utilizzare la riga di cellule Jurkat (ATCC, CD3 + umano linea cellulare dei linfociti) come controllo negativo. Cellule in coltura Jurkat RPMI1640 supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1,5 g / L di bicarbonato di sodio, 10 HEPES mM e 1.0 mM di piruvato di sodio.
2. La raccolta e l'attivazione di effettori autoreattivi cellule T CD8 +
NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] e NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] sono stati acquistati da The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) e allevati nella nostra struttura mouse. F1 progenie ibrida da accoppiamenti di NOD-AI4a con NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] sviluppare il diabete a 3-5 settimane di età. Tutti i topi sono stati ospitati in specifici esenti da organismi patogeni strutture e approvato dalla cura degli animali all'istituzione competente e del comitato Usa.
- Eutanasia 3-4 settimana di vita NOD-AI4a / b topo, utilizzando CO 2.
- Raccogliere milza di topi. Topi eutanasia sono preparati con spray etanolo e aperto sotto il cofano chirurgico. Milza vengono rimossi e messi in gelide tampone HBSS immediatamente.
- Raccogliere le cellule della milza con un 7 ml di vetro omogeneizzatore. Due o tre ogni milza sono messi in 5 ml di HBSS freddo e omogeneizzato con una ML 7, vetro omogeneizzatore. Omogeneizzato viene raccolto e centrifugato a 1200rpm per 5 minuti a 4 ° C con una Sorvall RT7 centrifuga +. Pellet cellulari sono raccolti.
- Rimuovere i globuli rossi con il trattamento ipotonico soluzione. I pellets sono trattati con 5 ml di soluzione ipotonica / milza in ghiaccio per 5 minuti, poi neutralizzato con l'aggiunta di un uguale volume di HBSS. Raccogliere le cellule per centrifugazione, come sopra, e risospendere in 50 HBSS ml. Passare attraverso le cellule sospese filtro cellulare e conta con un emocitometro con colorazione TrypanBlue.
- Attivare le cellule. Risospendere le cellule a 5x10 6 / ml e attivare utilizzando una cultura 3 giorni con 0,1 mM AI4 mimotopo (amino YFIENYLEL sequenza di acido) e 25 U / mL di IL-2 in RPMI1640 supplementato con 10% FBS, 2 mM L-glutammina, 1,5 g / L bicarbonato di sodio, 10 HEPES mM e 1.0 mM di piruvato di sodio.
3. 51 saggio di rilascio Cr esaminare CML
- Cellule bersaglio Etichetta: Aggiungi 51 Cr di indirizzare le cellule a 1 μCi / bene e cultura per 3 ore, e lavare 3 volte con terreno di coltura.
- Sospendere cellule effettrici in RPMI 1640 medium, come indicato al punto 2,5 in modo che il volume finale aggiunti a ciascun pozzetto è di 200 microlitri.
- Dopo l'ultimo lavaggio delle cellule bersaglio marcato, aggiungere attivato cellule effettrici di colture di cellule effettrici il target a bersaglio desiderato (E: T) rapporti. Usiamo solitamente E: T ratio a 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 e 50:1.
- Aggiungi fresca modificato RPMI 1640 medium (vedi punto 2.5) a 6 pozzi di cellule bersaglio per fungere da controllo lisi spontanea.
- Co-coltura le cellule effettrici e la destinazione di 16 ore.
- Raccogliere il supernatante in tubi 6x50 mm Vetro Lime
- Lisare le cellule con l'aggiunta di 100μl 2% SDS e pipettaggio più volte con delicatezza.
- Raccogliere lisato cellulare in un altro insieme di tubi 6x50 mm Vetro Lime.
- Lavare una volta con i pozzi puliti H 2 O e aggiungere il lavaggio di tubi lisato la cella.
- Contare il supernatanti e lisati cellulari mediante un contatore gamma.
- Calcolare lisi specifica quanto segue:
4. Colorazione delle cellule per l'imaging cellulare dal vivo
Tra le più comunemente utilizzati coloranti potenziale della membrana mitocondriale, TMRM espone la tossicità mitocondriale meno. 3 Perciò, scegliamo TMRM per questi studi dal vivo imaging cellulare.
- Preparare uno stock 40 mM soluzione TMRM in DMSO e conservare a -20 ° C. Fare una [25 nM] fresca soluzione di lavoro in rosso fenolo senza DMEM con tutti i supplementi per NIT-1 coltura cellulare 1.
- Macchia obiettivo NIT-1 con cellule TMRM 25 nM per 30 min a 37 ° C.
- Sostituire il supporto con mezzi freschi contenente 5 nM TMRM a mantenere la distribuzione di equilibrio del colorante 4.
- Conte attivato cellule T effettrici AI4 utilizzando un hematocytometer.
- Macchia attivato AI4 effettrici delle cellule T con 1 ml / ml per PicoGreen5 minuti a temperatura ambiente e lavare con rosso fenolo senza terreno di coltura per 3 volte.
5. La valutazione dei linfociti T-mediata morte delle cellule beta utilizzando l'imaging cellulare dal vivo
- Montare il coprioggetti camerati con le cellule NIT colorate sul palco di una Zeiss LSM 510 microscopio confocale. Rimuovere la linguetta con un dremmel e il gas sterilizzare il vetro con ossido di etheline camerati. Il palco è dotato di un live-cellule in camera di imaging che ha temperatura controllata a 37 ° C e 5% di CO 2 con l'umidità.
- Aggiungi attivato e colorate le cellule T per camere designato a diversi E: T ratio.
- Ha aggiunto lo stesso numero di cellule Jurkat colorate alle camere di controllo.
6. Ottenere immagini di cellule vive
Il microscopio è dotato di uno stadio motorizzato che ci ha permesso di acquisire le immagini riprese in luoghi diversi dalle camere stesso o diverso automaticamente nel corso del tempo l'esperimento.
- Utilizza un obiettivo 63x obiettivo di olio, prendete le immagini ad un intervallo di ogni 3 minuti per un totale di 300 fotogrammi al luogo.
- Rileva colorazione TMRM utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 543 nm e set di filtri per l'emissione di 565-619 nm
- Rileva colorazione PicoGreen utilizzando una eccitazione 488 nm e un set di filtri per l'emissione di 500-630 nm. Il video è stato creato utilizzando il software LSM Zeiss.
7. Conversione video per la pubblicazione
- Utilizzando il software LSM Zeiss, creare un file compresso filmato in un formato AVI.
- Per convertire i video nel formato di pubblicazione, importare il video nel pacchetto software FIJI ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), un ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) distribuzione, usando il plugin Bioformats da LOCI ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Regolare le impostazioni di luminosità e il contrasto per bilanciare i segnali verde e rosso e il frame rate è stato fissato a 2 fotogrammi / secondo utilizzando il menu opzioni di animazione.
- Ritagliare il video a 512 x 512 pixel ed esportare come un file AVI non compresso.
- Aprire questo file AVI nel software QuickTime 7 (computer Apple, Cupertino, CA) e comprimere e di esportazione nel formato aperto di file video H264/MPEG-4 a 1200 kbs / secondo.
8. Rappresentante dei risultati:
- Un risultato rappresentativo di 51 test Cr CML. La Figura 1 mostra un risultato rappresentativo di un saggio in cui CML lisi specifiche per cento (asse Y) aumenta con l'Effector: rapporto di destinazione (asse X) aumenta. Cellule bersaglio sono isolotti primarie isolate da immunodeficienti NOD RAG1-/ -. Topi ed etichettato con 51 Cr. Splenociti da topi transgenici NOD.AI4α / β sono isolati e attivata come descritto al punto 2. Obiettivi e effettori sono stati co-coltura per 16 ore. Lisi specifiche per cento è calcolato come descritto al punto 3.11.
- Due rappresentative (positivi e negativi) i risultati di una T cellulo-mediata della membrana delle cellule beta dissipazione mitocondriale potenziali sono presentati. Le cellule sono colorate e le reazioni sono registrate come descritte ai punti 4, 5 e 6 di cui sopra, i file video sono creati come al punto 7. Video 1: La versione beta linea di topi cellule NIT-1 è stato macchiato il potenziale di membrana mitocondriale TMRM colorante (rosso). Attivato, autoreattivi delle cellule T CD8 + AI4 (verde tinto con PicoGreen) sono stati co-coltura con queste NIT-1 le cellule a E: T rapporto di 50:1. NIT-1 potenziale della membrana mitocondriale dissipata gradualmente nel corso di 400 minuti di durata, ma solo nei distretti che sono stati interagendo con le cellule T AI4. Video 2: Come esperimento di controllo, NIT-1 le cellule sono state colorate con TMRM e co-coltura con cellule Jurkat PicoGreen colorate a E: T rapporto di 50:1. Cellule Jurkat sono un essere umano linea di cellule T che è MHC non corrispondenti. NIT-1 le cellule mantenuto il potenziale della membrana mitocondriale per tutta la durata dei 400 minuti di co-incubazione. Cellule Jurkat non hanno interagito con NIT-1 cluster e quindi non provocare l'uccisione.
Figura 1 risultato Rappresentante della LMC utilizzando come isolotti cellule bersaglio primario isolate da immunodeficienza NOD.Rag1-/ -. Topi e splenociti da topi transgenici NOD.AI4α / β. Obiettivi e effettori sono stati co-coltura per 16 ore. Lisi per cento specifica aumenta con l'Effector: aumenta il rapporto di destinazione.
Video 1. Linea di cellule beta del mouse NIT-1 è stato macchiato il potenziale della membrana mitocondriale TMRM colorante (rosso). Attivato autoreattivi delle cellule T CD8 + AI4 (verde tinto con PicoGreen) sono stati co-coltura con queste NIT-1 le cellule in E: rapporto T di 50:1. NIT-1 potenziale di membrana mitocondriale dissipazioneTed gradualmente nel corso di 400 minuti di durata, ma solo nei distretti che sono stati interagendo con verde AI4 cellule T. Clicca qui per vedere il video .
Video 2. NIT-1 le cellule sono state colorate identiche a quelle descritte nel video 1 e co-coltura con PicoGreen macchiata linea di cellule umane Jurkat T. NIT-1 le cellule erano in grado di mantenere il potenziale della membrana mitocondriale pensato la durata di 400 minuti. Cellule Jurkat non hanno interagito con NIT-1 cluster e quindi non provocare l'uccisione. Clicca qui per vedere il video .
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Discussion
Cellule T citotossiche mediate la morte delle cellule beta è la fisiopatologia principale di diabete di tipo 1 5. Saggi di CML con 51 rilascio Cr ci permettono di studiare il grado di effettrici bersaglio risposta 6. Tuttavia, il processo dettagliate e percorsi di T mediata dalle cellule morte delle cellule beta non è ancora pienamente compreso. Dal momento che i mitocondri sono fondamentali per la funzione delle cellule beta e la morte 7, ci siamo concentrati sui cambiamenti mitocondriali durante la CML visiva. Dissipazione del potenziale di membrana mitocondriale è un primo passo e irreversibile durante i cambiamenti mitocondriale funzionale che porta all'apoptosi 8. Usando cellule vive di imaging confocale microscopia, siamo stati in grado di visualizzare delle cellule beta mitocondriale dissipazione del potenziale di membrana durante le interazioni con i linfociti T autoreattivi. Questa impostazione sperimentale riproduce almeno una parte di ciò che accade alle cellule beta durante lo sviluppo del diabete di tipo 1. Limitazioni di questo esperimento sono: l'inserto di riscaldamento per l'imaging cellulare dotato di vivere il nostro microscopio Zeiss è stato progettato per i piatti cm 3.5 Petri, quindi quando si utilizzano ben 8-Lab-Tak II chambered coprioggetti (per la registrazione simultanea di trattati e controlli), la maniglia sul coprioggetti chambered deve essere rimosso al fine di adattarsi l'inserto microscopio. Inoltre, poiché l'inserto di riscaldamento è stato progettato per un piatto 35 millimetri Petri, quando usiamo ben 8-Lab-Tak II chambered coprioggetti, siamo stati limitati al centro di 4 pozzi. Questa limitazione può essere facilmente risolto con l'installazione di un inserto di riscaldamento specificamente progettato per Lab-Tak II chambered coprioggetti da Zeiss. Eventuali modifiche di questo esperimento anche con organismi geneticamente le cellule T effettrici fluorescenti ad attaccare le cellule bersaglio, o test vie di segnalazione delle citochine o interazioni cellula-cellula. La morte delle cellule beta nella patogenesi del diabete di tipo 1 è un processo complicato, coinvolge molteplici vie inclusi ma non limitati a, citochine granzima e perforina 9, Fas / Fas ligando 9, 10. Ci sono substrati fluorescenti per la caspasi e B granzima disponibili in commercio, con queste scelte è possibile studiare percorsi e la sequenza di eventi durante la morte delle cellule beta.
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Disclosures
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dalla University of Animal Care Florida e del Comitato Istituzionale Usa.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni dal National Institutes of Health DK074656 e AI56374 (CEM), così come la Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
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