Summary
Mediada por células-linfocitotoxicidade (CML) os ensaios podem ser usados para testar as respostas auto-reativos e mecanismos de estudo de morte celular in vitro. No entanto, usando live-célula confocal técnicas de imagem microscópica com corantes fluorescentes, do tipo e da cinética de morte celular, bem como as vias utilizadas podem ser estudados em maior detalhe.
Abstract
Diabetes tipo 1 (DM1) é uma doença mediada por células T auto-imunes. Durante a patogênese, os pacientes tornam-se progressivamente mais insulinopenic como a produção de insulina está perdido, presumivelmente, o que resulta da destruição das células beta pancreáticas pelas células T. Compreensão dos mecanismos de morte das células beta durante o desenvolvimento do DM1 irá fornecer informações para gerar uma cura eficaz para esta doença. Mediada por células linfocitotoxicidade (CML) ensaios têm historicamente utilizado o Chromium radionuclídeos 51 (51 Cr) para rotular as células-alvo. Estas metas são, em seguida, expostos a células efetoras e da liberação de 51 Cr a partir de células-alvo é lido como uma indicação de linfócitos mediada por morte celular. Inibidores de resultado morte celular na liberação diminuída de 51 Cr.
Como células efetoras, usamos uma população autoreactive ativado clonal de linfócitos CD8 + T citotóxicas (CTL) isolado de um camundongo transgênico estoque para ambas as cadeias alfa e beta do receptor de células T AI4 (TCR). Ativado AI4 células T foram co-cultivados com células-alvo 51 Cr rotulados NIT por 16 horas, a liberação de 51 Cr foi gravado para calcular a lise específica
Mitocôndrias participar em muitos eventos fisiológicos importantes, como a produção de energia, regulação da transdução de sinalização e apoptose. O estudo da célula beta mitocondrial alterações funcionais durante o desenvolvimento do DM1 é uma área nova de pesquisa. Usando o potencial de membrana mitocondrial corante Rodamina Tetrametil Methyl Ester (TMRM) e imagens de células microscópicas confocal vivemos, nós monitorados potencial de membrana mitocondrial ao longo do tempo na linha da célula beta NIT-1. Para exames de imagem, AI4 células T efectoras foram marcadas com o corante fluorescente coloração nuclear Picogreen. NIT-1 e células T foram co-cultivados em câmaras lamínula e montado sobre o palco microscópio equipado com uma câmara de células vivas, a 37 ° C, com 5% de CO 2, e umidificado. Durante esses experimentos imagens foram tiradas de cada cluster a cada 3 minutos para 400 minutos.
Mais de um curso de 400 minutos, observou-se a dissipação do potencial de membrana mitocondrial em NIT-1 grupos de células, onde AI4 células T foram anexados. No experimento controle simultâneo onde NIT-1 as células foram co-cultivados com MHC desencontradas células Jurkat linfócitos, potencial de membrana mitocondrial permaneceu intacta. Esta técnica pode ser usada para observar em tempo real as mudanças no potencial de membrana mitocondrial em células sob ataque de linfócitos citotóxicos, citocinas, ou outros reagentes citotóxicos.
Protocol
1. Preparação de células
- Cultura de células alvo: Cultura do mouse linhas de células beta, NIT-1 e NIT-4, foi um 1,2 descrito anteriormente em DMEM suplementado com 10% de SFB, BSA 0,02%, não-essenciais Aminoácidos, 15mM HEPES, 16.5mm Glocose e penicilina / estreptomicina. Por 51 Cr rotulagem, as células de semente em um flat-bottom de 96 poços na placa de cultura 5X10 4 células / poço em 200 mL meio de cultura. Para experimentos de microscopia, as células de semente em um oito bem-Lab-Tak II chambered lamela em 5x10 4 por câmara em 500 mL meio de cultura, e deixe crescer por 48 horas antes de usar nos experimentos de citotoxicidade.
- Controle T cultura linha celular: Use a linha de células Jurkat (ATCC, CD3 + linha de células de linfócitos humanos) como controle negativo. Cultura de células Jurkat em RPMI1640 suplementado com 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, bicarbonato de sódio 1,5 g / L, 10 mM HEPES e 1,0 mM piruvato de sódio.
2. Coleta e ativação de efetores autoreactive células T CD8 +
NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4a] e NOD.Cg-RAG1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ [NOD-AI4b] foram adquiridos do Laboratório Jackson (Bar Harbor, ME) e criados em nossa unidade de mouse. Progênie híbrida F1 a partir de acasalamentos de NOD-AI4a com NOD-AI4b [NOD-AI4a / b] desenvolver diabetes em 3-5 semanas de idade. Todos os animais foram alojados em patógenos específicos livre de instalações e aprovadas pelo Atendimento a instituição do Comitê Animal e Uso.
- Euthanize 3-4 semanas de idade NOD-AI4a / b camundongos usando CO 2.
- Coletar baços de camundongos. Camundongos sacrificados são preparados com spray de etanol e abriu sob o capô cirúrgico. Baços são removidos e colocados em gelo frio tampão HBSS imediatamente.
- Coletar células do baço usando um homogeneizador de vidro 7 mL. Dois a três baços cada são colocados em 5 mL de HBSS frio e homogeneizado com um 7 mL de vidro homogeneizador. Homogeneizado é coletado e centrifugado a 1200rpm por 5 minutos a 4 ° C usando um Sorvall RT7 centrífuga +. Pellets celulares são recolhidos.
- Remover as células vermelhas do sangue usando o tratamento solução hipotônica. Pelotas são tratados com 5 mL de solução hipotônica / baço em gelo durante 5 minutos, em seguida neutralizada pela adição de igual volume de HBSS. Coletar células por centrifugação, como acima, e ressuspender em 50 HBSS mL. Passe as células em suspensão através de peneira de células e contagem utilizando um hemocitômetro com coloração TrypanBlue.
- Ativam as células. Ressuspender as células em 5x10 6 mL / e ativar usando uma cultura 3 dias com 0,1 mM AI4 mimotope (YFIENYLEL sequência de aminoácidos) e 25 U / mL IL-2 em RPMI1640 suplementado com 10% de SFB, 2 mM L-glutamina, 1,5 g / L de bicarbonato de sódio, 10 mM HEPES e 1,0 mM piruvato de sódio.
3. 51 ensaio de liberação de Cr para examinar CML
- Células-alvo etiqueta: Add 51 Cr para atingir as células em 1 μCi / poço e cultura para 3 horas, e lavar 3 vezes com meio de cultura.
- Suspender células efetoras em meio RPMI 1640, como mencionado no passo 2,5 para que o volume final adicionados a cada poço é de 200 mL.
- Após a lavagem final das células-alvo rotulado, adicione ativação de células efetoras para as culturas de células-alvo em efetoras desejado para o destino (E: T) rácios. Nós usamos geralmente E: relações T em 0.4:1, 1:1, 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 e 50:1.
- Adicionar novas modificada RPMI 1640 (veja o passo 2.5) a 6 poços de células-alvo para atuar como um controle de lise espontânea.
- Co-cultura de células efetoras e meta para 16 horas.
- Recolher o sobrenadante em tubos de vidro 6x50 milímetros Lime
- Lisar células adicionando 100μl SDS 2% e pipetagem várias vezes suavemente.
- Coletar lisado celular em outro conjunto de 6x50 milímetros tubos de vidro Lime.
- Lavar uma vez com poços limpa H 2 O e adicione a lavagem para os tubos lisado celular.
- Contar os sobrenadantes e lisados celulares usando um contador gama.
- Calcular a lise específica da seguinte forma:
4. Coloração de células para imagens de células vivas
Entre os mais comumente utilizados corantes potencial de membrana mitocondrial, TMRM exibe a toxicidade mitocondrial, pelo menos. 3 Por isso, escolhemos TMRM para estes estudos de imagem de células vivas.
- Prepare uma solução de 40 mM TMRM estoque em DMSO e armazenar a -20 ° C. Faça uma [25 nM] solução de trabalho fresca em vermelho de fenol livre de DMEM com todos os suplementos para NIT-1 cultura de células 1.
- Mancha-alvo NIT-1 com células TMRM 25 nM por 30 min a 37 ° C.
- Substituir a mídia com a mídia fresco contendo 5 nM TMRM para manter a distribuição de equilíbrio dos 4 corante.
- Contar efetoras ativadas AI4 células T usando um hematocytometer.
- Mancha efetoras ativadas AI4 células T com 1 ml / mL para Picogreen5 minutos à temperatura ambiente e lave com vermelho de fenol livre de meio de cultura 3 vezes.
5. Avaliação de linfócitos T mediada por morte de células beta usando imagens de células vivas
- Montar a lamínula chambered com células NIT manchada no palco de uma Zeiss LSM 510 microscópio confocal. Remova a guia com um dremmel e gás esterilizar o vidro com óxido de câmaras Etheline. O palco é equipado com uma câmara de imagens ao vivo de células que tem temperatura controlada a 37 ° C e 5% CO 2 com a umidade.
- Adicionar ativado e corados células T para câmaras designados ao E diferente: relações T.
- Adicionado mesmo número de células Jurkat manchada para as câmaras de controle.
6. Obtenção de imagens de células vivas
O microscópio é equipado com um palco motorizado que nos permitiu adquirir imagens repetidas vezes em diferentes locais das câmaras iguais ou diferentes automaticamente ao longo do tempo do experimento.
- Usando uma lente 63x de petróleo objetivo, tirar fotos em um intervalo de três minutos cada para um total de 300 quadros por localização.
- Detectar coloração TMRM usando um comprimento de onda de excitação de 543 nm e conjunto de filtros para emissão de 565-619 nm
- Detectar Picogreen coloração com uma excitação 488 nm e um conjunto de filtros para emissão de 500-630 nm. O vídeo foi criado usando software Zeiss LSM.
7. Conversão de vídeo para publicação
- Usando o software LSM Zeiss, criar um arquivo de filme não compactado em um formato AVI.
- Para converter o vídeo para o formato publicado, importe o vídeo para o pacote de software FIJI ( http://pacific.mpi-cbg.de/wiki/index.php/Fiji ), um ImageJ ( http://rsb.info. nih.gov / ij / ) de distribuição, usando o plugin Bioformats de locos ( http://www.loci.wisc.edu/software/bio-formats ).
- Ajustar as configurações de brilho e contraste para equilibrar os sinais verde e vermelho ea taxa de quadros foi definido como 2 frames / segundo usando a animação do menu de opções.
- Recortar o vídeo para 512 x 512 pixels e exportar como um arquivo AVI sem compressão.
- Abrir este arquivo AVI no QuickTime 7 software (computador Apple, Cupertino, CA) e comprimir e de exportação no formato aberto de arquivo de vídeo H264/MPEG-4 a 1200 kbs / segundo.
8. Resultados representativos:
- Um resultado representativo de 51 ensaio CML Cr. A Figura 1 mostra um resultado representativo de um ensaio onde CML lise por cento específicos (eixo Y) aumenta à medida que o Effector: relação Target (eixo X) aumenta. Células-alvo são ilhotas primária isolada a partir de NOD imunodeficientes RAG1-/ -. Ratos e rotulado com 51 Cr. Esplenócitos dos NOD.AI4α / β camundongos transgênicos são isoladas e ativados como descrito na etapa 2 acima. Metas e efetores foram co-cultivados por 16 horas. Lise por cento específico é calculado conforme descrito no passo 3.11.
- Dois representante (positivo e negativo) resulta de um T-mediada por células beta dissipação de célula de membrana mitocondrial em potencial são apresentados. Células são coradas e reações são registradas como descrito nas etapas 4, 5 e 6 acima, arquivos de vídeo são criados como no passo 7. Vídeo 1: O mouse linhagem de células beta NIT-1 foi manchado o potencial de membrana mitocondrial TMRM corante (vermelho). Ativado, autoreactive CD8 + células T AI4 (verde manchado com Picogreen) foram co-cultivados com essas NIT-1 células em uma razão E: T de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial dissipada gradualmente durante uma duração de 400 minutos, mas apenas nos clusters que foram interagindo com células T AI4. Vídeo 2: Como um experimento de controle, NIT-1 as células foram coradas com TMRM e co-cultivados com células Jurkat Picogreen manchada em uma razão E: T de 50:1. Células Jurkat são uma linha de células T humanas que é MHC incompatíveis. NIT-1 células mantidas potencial de membrana mitocondrial durante toda a duração de 400 minutos a co-incubação período. Células Jurkat não interagir com NIT-1 clusters e, portanto, não provocar o assassinato.
Figura 1 resultado Representante da CML usando como células-alvo primárias ilhotas isoladas de imunodeficientes NOD.Rag1-/ -. Ratos e esplenócitos de NOD.AI4α / β camundongos transgênicos. Metas e efetores foram co-cultivados por 16 horas. Lise por cento específica aumenta com o Effector: aumenta a proporção Target.
Vídeo 1. Rato linha de células beta NIT-1 foi manchado a membrana mitocondrial potencial corante TMRM (Red). Ativado autoreactive CD8 + células T AI4 (verde manchado com Picogreen) foram co-cultivados com essas NIT-1 em células razão E: T de 50:1. NIT-1 potencial de membrana mitocondrial dissipaçãoted gradualmente durante uma duração de 400 minutos, mas apenas nos clusters que estavam interagindo com o verde AI4 células T. Clique aqui para assistir ao vídeo .
Video 2. NIT-1 as células foram coradas mesma, conforme descrito no vídeo 1 e co-cultivados com Picogreen T humanas manchada Jurkat linha celular. NIT-1 as células foram capazes de manter o potencial de membrana mitocondrial pensado a duração de 400 minutos. Células Jurkat não interagir com NIT-1 clusters e, portanto, não provocar o assassinato. Clique aqui para assistir ao vídeo .
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Discussion
Citotóxica de células T morte celular mediada beta está a fisiopatologia das principais DM1 5. CML ensaios utilizando 51 Cr lançamento nos permitem estudar o grau de meta-efetoras de resposta 6. No entanto, o processo detalhado e os caminhos da morte das células T mediada por células beta ainda não é totalmente compreendido. Uma vez que as mitocôndrias são críticos para a função das células beta ea morte 7, centrada em mudanças mitocondrial durante a CML visual. Dissipação de membrana mitocondrial em potencial é um passo inicial e irreversível durante as mudanças funcionais mitocondrial, levando à apoptose 8. Usando microscopia confocal imagens de células vivas, fomos capazes de visualizar células beta dissipação potencial de membrana mitocondrial durante as interações com os linfócitos T auto-reativos. Esta configuração experimental imita pelo menos parte do que acontece com as células beta durante o desenvolvimento de DM1. Limitações desta experiência são: a inserção de aquecimento para imagens de células vivas equipado com o nosso microscópio Zeiss foi projetado para 3,5 centímetros pratos Petri, portanto, quando se utiliza oito bem-Lab-Tak II chambered lamela (para gravação de, simultaneamente, tratados e controles), a alça de na lamela chambered precisa ser removido, a fim de encaixar a inserção microscópio. Além disso, como a inserção de aquecimento é projetado para uma placa de Petri de 35 mm, quando usamos oito bem-Lab-Tak II chambered lamela, estávamos limitados ao centro 4 poços. Esta limitação pode ser facilmente resolvido com a instalação de uma inserção de aquecimento projetado especificamente para Lab-Tak II chambered lamela por Zeiss. Possíveis modificações deste experimento incluindo o uso de fluorescentes geneticamente células T efectoras para atacar as células-alvo, ou teste de vias de sinalização de citocinas ou interações célula-célula. A morte das células beta na patogênese da DM1 é um processo complicado, envolve múltiplas vias, incluindo mas não limitado a, as citocinas granzima e perforina 9, Fas / Fas ligante 9, 10. Existem substratos fluorescentes para caspases e granzima B disponíveis comercialmente, com estas escolhas, é possível estudar as vias e da seqüência de eventos durante a morte das células beta.
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Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade da Flórida Animal Care Institucional e Comitê de uso.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por subvenções dos Institutos Nacionais de Saúde e DK074656 AI56374 (CEM), bem como o Juvenile Diabetes Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cr-51 | PerkinElmer, Inc. | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | amino acid sequence: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R&D Systems | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | Hyclone | SH30071.03 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini Bio Products | 400-109 | |
| Phenol red-free DMEM | Sigma-Aldrich | D5303 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | HeraCell 150i | Kept sterile for cell culture |
| Biological safety cabinet | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Forma 1440 | |
| Disposable culture tubes, 6x50 mm Lime Glass | Fisher Scientific | 14-958-A | |
| Gamma Counter | PerkinElmer, Inc. | Wizard 1470 Automatic Gamma Counter | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 510 Meta Confocal | With motorized stage and live cell chamber |
| Pipette (1ml, 200μl, 20μl,10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| Tubes (Amber) | Fisher Scientific | 50819772 | |
| Centrifuge | Sorvall, Thermo Scientific | 75004377 | |
| Hemacytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| Upright Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcraAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1tm1Mom Tg(TcrbAI4)1Dvs/DvsJ Mice | Jackson Laboratory | 004348 | |
| NOD-AI4α/ β F1 mice | N/A | N/A | Bred in UF animal facility |
References
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- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd2a modifies resistance against autoimmune Type 1 diabetes in NOD mice at the level of the pancreatic beta cell. Diabetes. , (2010).
- Scaduto, R. C., Grotyohann, L. W. Measurement of mitochondrial membrane potential using fluorescent rhodamine derivatives. Biophys J. 76, 469-477 (1999).
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