Summary
Trichuris Muris-infectie is een intestinale model van de Th2-immuniteit, waar resistente muizen genereren van een beschermende Th2 respons en vatbaar zijn muizen het genereren van een pathologische Th1 respons.
Abstract
Trichuris Muris is een natuurlijke ziekteverwekker van muizen en is biologisch en antigeen vergelijkbaar met soorten Trichuris dat mensen en vee een infecteren. Infectieuze eieren worden gegeven door orale sondevoeding, luik in de distale dunne darm, binnen te vallen van de darmepitheelcellen (IECS) die lijn de crypten van de blindedarm en proximale dikke darm en op de rijping van de wormen eieren introductie in het milieu 1. Dit model is een krachtig hulpmiddel om factoren te onderzoeken die de controle CD4 + T-helper (Th) cel activatie en de veranderingen in het darmepitheel. De immuunrespons die optreedt in resistente inteeltstammen, zoals C57BL / 6 en BALB / c, wordt gekenmerkt door Th2 gepolariseerd cytokines (IL-4, IL-5 en IL-13) en de uitzetting van wormen, terwijl Th1-geassocieerde cytokines (IL -12, IL-18, IFN-γ) het bevorderen van chronische infecties in genetisch gevoelige AKR / J muizen 2-6. Th2 cytokines bevordering van fysiologische veranderingen in de intestinale micro-omgeving waaronder snelle omzet van IECS, beker celdifferentiatie, recruitment en veranderingen in de epitheliale permeabiliteit en gladde spiercontractie, die allen zijn betrokken bij worm uitzetting 7-15. Hier hebben we detail een protocol voor het uitdragen van Trichuris Muris eieren die gebruikt kunnen worden in de volgende experimenten. We bieden ook een voorbeeld van experimenteel oogst met suggesties voor post-infectie-analyse. In het algemeen zal dit protocol te bieden onderzoekers met de basisinstrumenten voor een Trichuris Muris muis infectie-model dat gebruikt kan worden om vragen met betrekking tot Th neiging in het maag-darmkanaal en immuun effectorfuncties van IECS te pakken uit te voeren.
Protocol
1. Het uitdragen van Trichuris Muris eieren
- Voor het genereren van nieuwe partijen Trichuris Muris eieren, infecteren 20-30 immunodeficiënte muizen (bijv. NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) of 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) of genetisch gevoelige muizen ( bijvoorbeeld. AKR / J), die 6-8 weken oud met ongeveer 300 Trichuris Muris eieren door orale sondevoeding.
- Na 32-35 dagen offeren de muizen door de CO 2 stikken.
- Expose de ventrale zijde van de muis en nat van de buik met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang grijpen de buikhuid en maken een kleine incisie met een schaar. Snijd de huid om de buikinhoud bloot te leggen.
- Identificeer de blindedarm en de proximale dikke darm, en verwijder ze.
- Plaats de blindedarm en proximale dikke darm in een 10 cm petrischaaltje met Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) met 500 U / ml penicilline en 500 ug / ml streptomycine (P / S). Snijd de blindedarm open voor het lumen en de wormen bloot te leggen. Met behulp van een tang plaats blindedarm in een bekerglas van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en schud zachtjes om uitwerpselen te verwijderen.
- Keer terug naar blindedarm petrischaal en het gebruik van vloeiende gebogen pincet (Roboz RS-5047) Trek hem voorzichtig uit wormen en ze in een put van een 6 wells plaat met daarin 5 ml van DMEM + P / S. plaats
- Herhaal dit proces voor alle muizen.
- Leg 6 wells plaat in een Tupperware bakje met een vochtig papieren doekje voor vocht en incubeer te handhaven op 37 ° C gedurende 4 uur.
- Na 4 uur te verwijderen met behulp van wormen glad gebogen pincet en splitsen ze in twee nieuwe putjes van de 6 wells plaat met daarin 5 ml DMEM + P / S. Oogst de inhoud van de oorspronkelijke goed en in een 15 ml falcon buis. Spin buis bij 3000 toeren per minuut en te verwijderen en te reserveren supernatant als 4 uur antigeen (kan gebruikt worden voor mobiele restimulatie na PBS dialyse, waar typische eiwitten opbrengsten 10-20 mg per 20 muizen) en resuspendeer ei-bevattende pellet in geautoclaveerd kraanwater.
- Plaats de 6 wells plaat bij 37 ° C gedurende de nacht. Verwijderen en afvoeren van de wormen. Oogst de inhoud van de putten in een valk buis en draaien op 3000 rpm gedurende 5 minuten. Verwijder supernatant en reserveer als 's nachts antigeen (kan worden gebruikt voor Trichuris Ag specifiek antilichaam isotype ELISA na PBS dialyse, waar typische eiwitten opbrengsten 10-20 mg per 20 muizen) en resuspendeer ei-bevattende pellet in geautoclaveerd kraanwater.
- Combineer vier uur en 's nachts eieren en filter de eieren door de 70μm zeef om verwijder vervolgens alle resterende wormen te zetten in een 75 cm 2 kolf. Houden kolf in een donkere plaats in folie gedurende 6 weken bij kamertemperatuur (RT).
- Was de eieren in geautoclaveerd kraanwater en resuspendeer op 50 levensvatbare eitjes in 50 ui. Om dit te doen, centrifuge eieren op 3000 rpm gedurende 5 minuten en resuspendeer in ~ 50 ml steriel leidingwater. Verwijder 50 ul eieren en leg ze op een glasplaatje. Met behulp van de 40x vergroting tel het aantal levensvatbare bevruchte eieren in de 50 ui. Verdunnen eieren tot 50 levensvatbare eitjes te geven in 50 ui. Voor afbeeldingen van levensvatbare eitjes zie de studie van Kopper en Mansfield 16.
2. Acute infectie van de experimentele muizen met Trichuris Muris eieren (200 eieren / muis)
- Grondig mengen eieren en verwijder genoeg volume om het aantal muizen te behandelen X 2 (bv. voor 10 muizen te nemen 200 pi x 10 muizen x 2 = 4 ml van eieren) en ze in een 14 ml klikdop tube plaatsen.
- Keer de 14 ml snap cap tube om te mengen. Brengen 200 ul van eieren in 1 ml spuit op een geschikte grootte voeding naald (voor de muizen met een gewicht 25 gram gebruikten we 18 gauge 1 1 / 2 "naalden). In de ene hand nekvel de muis en met de andere hand eieren beheren door orale sondevoeding .
- Wacht 21 dagen.
3. Experimentele oogst
- Op dag 21 offeren de muizen met behulp van CO 2.
- Verzamel bloed van muizen met hart doorboren, in een niet-gehepariniseerd spuit, en bewaar bij 4 ° C. De volgende dag isoleren serum en invriezen bij -20 ° C. Serum kan worden gebruikt voor de detectie van Trichuris-specifieke IgE-en IgG's met behulp van ELISA.
- Expose de ventrale zijde van de muis en nat van de buik met 70% ethanol.
- Met behulp van een tang grijpen de buikhuid en maken een kleine incisie met een schaar. Snijd de huid en de onderliggende membraan naar de buikinhoud bloot te leggen.
- Identificeer de dunne darm, blindedarm en dikke darm. Pak de blindedarm met een tang en trek van de buikholte. Met een andere tang push dunne darm op aan de rechterkant het blootstellen van de mesenteriale lymfeklieren (mLNs). Verwijder de mLNs en let niet te snijden in de darmen en in een 15 ml falcon met 2 ml van media. Indien gewenst kunnen deze worden verwerkt en opnieuw gestimuleerd in vitro (4x10 6 / ml in 1 ml in 24 goed platen met 1 ug / ml αCD3/CD28 of met 50μg/ml 4u Trichuris Ag) voor 72 uur voor cytokine-analyse door ELISA en intracellulaire flage cytometrie.
- Knip de blindedarm en de dikke darm.
- Met behulp van een tang, 'push out' fecale pellets van distale colon en plaats in een 2 ml Axygen buis. Invriezen bij -20 ° C. Fecale pellets kunnen worden geanalyseerd door western blot voor expressie van resistine-like molecule-β (RELM-β).
- Verwijder het topje van de blindedarm (~ 0,5 cm). Voor het verwijderen van uitwerpselen te houden blindedarm tip met een pincet en spoelen met PBS met behulp van een 3 ml spuit en 22-gauge naald in een petrischaal. Plaats in verse 4% paraformaldehyde in een 5 ml Falcon snap cap tube. Bewaren bij 4 ° C. Deze kunnen worden in paraffine ingebedde, gesegmenteerd en gemonteerd op dia's voor histologische analyse.
- Verwijderen van een stuk van proximale colon (~ 1 cm) voor RNA. Doe monster in 2 ml Axygen buis met 500 ul RNAlater. Bewaren bij 4 ° C. Deze monsters kunnen worden geanalyseerd op mRNA expressie door qPCR.
- Leg de rest van de blindedarm in een gelabeld petrischaal en invriezen bij -20 ° C.
4. Opsomming van Trichuris Muris wormen in de blindedarm
- Verwijder de blindedarm van de vriezer en plaats in een petrischaaltje met ~ 5 ml water.
- Met behulp van schaar, opengesneden blindedarm aan de lumen bloot te leggen.
- Houd de blindedarm met een tang en schud de blindedarm om de meerderheid van de ontlasting te verwijderen.
- Overdragen blindedarm naar een andere petrischaaltje met water en het gebruik van licht gebogen pincet voorzichtig af te schrapen van de IECS het onderliggende weefsel.
- Overdracht blindedarm naar een nieuwe petrischaal met water en krachtig restmateriaal schrapen met een pincet, het rippen van het weefsel in kleine stukjes.
- Gebruik een dissectiemicroscoop om alle wormen tellen in alle drie van de petrischaaltjes. Als je een worm te verwijderen van de schotel naar dezelfde worm garanderen, is geen tweemaal geteld. Als wormen beschadigd zijn (dat wil zeggen gebroken half) tellen slechts een dikke of dunne uiteinden om een nauwkeurige telling te krijgen.
5. Representatieve resultaten
De Trichuris Muris infectie model stelt onderzoekers in staat te kwantificeren parasiet lasten en systemische immuunrespons, alsmede op histologisch onderzoek de ontstekingsreactie in het distale blindedarm. Wanneer het lumen van de geoogste blindedarm wordt blootgesteld, kan Trichuris wormen worden opgesomd met behulp van een dissectiemicroscoop (Figuur 1A-B). Parameters van immuniteit voor Trichuris ook antilichaam isotype omschakeling naar IgG1 (geassocieerd met Th2-type immuniteit) in resistente dieren, en IgG2a (in verband met Th1-type immuniteit) bij gevoelige dieren (figuur 1C). Expressie van de beker cel-specifiek eiwit resistine-like molecule-β (RELM-β) wordt geassocieerd met klaring van Trichuris en is detecteerbaar door Western blot-analyse (figuur 2). Het distale deel van de blindedarm kan worden gekleurd met Periodieke Acid-Schiff (PAS) om goblet cel responsen en de mate van intestinale ontsteking in reactie op infectie (figuur 3) te beoordelen.
Figuur 1. Kwantificering van immuniteit voor Trichuris Muris. (A) Resistant (B6) muizen te verdrijven Trichuris Muris op dag 21 na infectie. Daarentegen, worden gevoelig (AKR / J) muizen chronisch geïnfecteerd met Trichuris, wat resulteert in parasiet vestiging. Elke staaf staat voor het gemiddelde ± SEM van 4-8 dieren per groep. (B) Wormen zijn geteld met behulp van een dissectie microscoop. Top paneel toont wormen in isolement, onderste paneel toont wormen in de aanwezigheid van IECS en uitwerpselen. (C) Trichuris-specifieke IgG2a titers worden bepaald door ELISA van verdund serum (1:2 verdunning, te beginnen op 1:20 verdunning en eindigend bij 1:2560) op platen gecoat met uitscheidingsorganen Trichuris antigeen (O / N Ag, 5 ng / ml). Gevoelig AKR / J muizen hebben met name hogere niveaus van Trichuris-specifieke serum IgG2a dan resistent B6 muizen.
Figuur 2. Klaring van Trichuris Muris wordt geassocieerd met expressie van de beker cel-specifiek eiwit RELM-β 7. RELM-β productie kan worden gedetecteerd van fecale pellets uit Trichuris-geïnfecteerde bestand (B6), maar niet gevoelig (AKR / J) muizen door western blot analyse. Elke baan is representatief voor een enkel dier, (N) = Naïef, (Tm) = 21 dagen Trichuris geïnfecteerde muizen.
Figuur 3. Histologisch onderzoek van het distale blindedarm volgende Trichuris infectie. 5-7 um delen van het distale blindedarm gekleurd met PAS. Goblet cel hyperplasie en slijmproductie zijn duidelijk in resistente (B6), maar niet gevoelig (AKR / J) muizen na Trichuris infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol details van een standaard hoge dosis acute Trichuris Muris infectie die kan worden aangepast, zoals vereist door de onderzoeker. Kan bijvoorbeeld muizen worden opgeofferd en weefsels geoogst op verschillende dagen. Om vast te stellen dat de muizen met succes hebben volledige worm last vastgelegd kunnen worden opgeofferd op dag 14, en op dat moment alle muizen moet een last van ongeveer 200 wormen dragen. Muizen kunnen ook besmet worden voor 32 dagen waar geen worm ontdekt zal hebben bereikt, volwassen en zou blijven met gastheer voor de duur van zijn leven. Daarnaast kan het protocol worden aangepast aan chronische Trichuris Muris-infectie model. Om dit te doen, kan de toegediende dosis ei worden aangepast aan een lage dosis infectie (ongeveer 30 eieren). Bij deze dosis, meestal resistente muizen niet tot een beschermende Th2 respons induceren, maar het genereren van een Th1 respons en onderhouden van een last van ongeveer 20 wormen 17.
Een voordeel van de Trichuris Muris infectie model ten opzichte van andere infectie modellen is dat in het algemeen de geïnfecteerde muizen geen herkenbare morbiditeit en mortaliteit. Er zijn echter factoren die de experimentele uitkomst kunnen beïnvloeden dat onderzoekers zich bewust zou moeten zijn. De eerste factor is de achtergrond stam van de muizen. Zoals beschreven in de resultaten, C57BL / 6 muizen resistent zijn en AKR / J muizen vatbaar zijn, en, andersom, kunnen andere inteeltstammen een andere infectie profielen. Daarom is het belangrijk dat de onderzoeker zich bewust zijn van de achtergrond van hun stam muizen en het gebruik passende controle muizen. Daarnaast kan er muis-to-muis variatie in parasieten klaring, dus er is geen reden tot ongerustheid als sommige normaal resistent controle muizen hebben tot 30 wormen op 21 dagen na infectie. Ook zal gevoelig muizen niet altijd handhaven van een volledige 200-count worm last, maar kan variëren van ongeveer 75 tot 200 wormen per blindedarm. Deze variatie kan ook worden verklaard door natuurlijke variatie in darmflora van muizen gehuisvest in verschillende faciliteiten.
Een factor die een negatieve invloed Trichuris Muris-infectie is de aanwezigheid van pinworm. Oxyuren infecteren dezelfde anatomische site als Trichuris en induceren een immuunrespons die de interpretatie van de Trichuris studies kunnen verwarren. Bovendien pinworm behandeling (albendazol, fenbendazol) doodt ook Trichuris. In deze experimentele procedure maken we gebruik van muizen die worden bijgehouden onder bepaalde voorwaarden-pathogeen vrij, en het van het grootste belang dat de experimentele muizen worden gehouden pinworm vrij voorafgaand aan en tijdens Trichuris Muris-infectie.
Enkele kleine punten onderzoekers moeten zich bewust zijn van:
- Eieren moeten worden gehandhaafd in het water, niet PBS.
- Eieren zijn erg zwaar en daarom moet worden geresuspendeerd voor de levering aan elke muis. Ook, belasting slechts voldoende volume van de eieren tot een muis besmetten op een moment, want zij zullen zich in de spuit.
- Enkele zeldzame stammen vertonen sekseverschillen in besmettelijkheid, maar in de meeste gevallen, zowel mannen of vrouwen kan worden gebruikt voor Trichuris Muris infecties.
- Naïeve muizen kunnen worden gehuisvest in dezelfde kooi als geïnfecteerde muizen als er geen zorg van horizontale overdracht van een infectie met dit model.
Over het geheel genomen Trichuris Muris-infectie is een eenvoudige procedure om dat modellen Th2-afhankelijke immuniteit te voeren en kan worden aangepast aan de individuele behoeften van onderzoekers aan te passen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Experimenten op dieren werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en voorschriften uiteengezet door de Universiteit van British Columbia in te stellen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (MSH-95368, MOP-89773 en de MOP-106623 naar CZ) en de Canada Foundation for Innovation. SCM is de ontvanger van een CIHR / Canadese Vereniging van Gastro-enterologie postdoctoraal fellowship. CZ is een CIHR nieuwe onderzoeker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
- Cliffe, L. J., Grencis, R. K. The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection. Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).
- Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection. J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).
- Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths. Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).
- Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection. J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).
- Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13. J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).
- Owyang, A. M. Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).
- Artis, D. RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).
- Datta, R. Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite. Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).
- Cliffe, L. J. Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion. Science. 308, 1463-1465 (2005).
- Artis, D. New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes. Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).
- Finkelman, F. D. Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models. Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).
- Grencis, R. K. Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection. Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).
- Khan, W. I. Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections. Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).
- Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection. Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).
- Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).
- Kopper, J. J., Mansfield, L. S. Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse. Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).
- Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response. Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).
