Summary
Trichuris Muris infektion är en intestinal modell av Th2 immuniteten, om resistenta möss bildar ett skyddande Th2 respons och mottagliga möss generera en patologisk Th1 svar.
Abstract
Trichuris Muris är en naturlig patogen av möss och är biologiskt och antigena liknande arter av Trichuris som infekterar människor och djur 1. Infektiösa ägg ges via oral sondmatning, lucka i distala tunntarmen, invadera tarmcellerna (IECS) som kantar kryptor i blindtarmen och proximala kolon och på mognad maskarna frigöra ägg i miljön 1. Denna modell är ett kraftfullt verktyg för att undersöka faktorer som styr CD4 + T-hjälparceller (Th) celler aktivering samt förändringar i intestinal epitel. Det immunsvar som sker i resistenta inavlade stammar, såsom C57BL / 6 och BALB / c, kännetecknas av Th2 polariserad cytokiner (IL-4, IL-5 och IL-13) och utvisning av maskar medan Th1-associerade cytokiner (IL -12, IL-18, IFN-γ) främja kroniska infektioner hos genetiskt känsliga AKR / möss J 2-6. Th2 cytokiner främja fysiologiska förändringar i intestinal mikromiljön bland annat snabb omsättning av IECS, bägare celldifferentiering, rekrytering och förändringar i epitelial permeabilitet och smidig muskel kontraktion, som alla har varit inblandade i masken utvisning 7-15. Här har vi närmare ett protokoll för att sprida Trichuris Muris ägg som kan användas i kommande experiment. Vi tillhandahåller också en skörd prov experimentell med förslag för post-infektion analys. Sammantaget kommer detta protokoll att ge forskare med grundläggande verktyg för att utföra en Trichuris Muris modell musen infektion som kan användas för att behandla frågor som rör Th benägenhet i mag-tarmkanalen samt immunsystemets effektorsteg av IECS.
Protocol
1. Uppförökningsmaterial Trichuris Muris ägg
- Att generera nya partier av Trichuris Muris ägg, infektera 20-30 immundefekta möss (t.ex. NOD.Cg-Prkdc Scid Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) eller 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) eller genetiskt känsliga möss ( t ex. AKR / J) som är 6-8 veckor gamla med ca 300 Trichuris Muris ägg via oral sondmatning.
- Efter 32-35 dagar offra de möss med CO 2 kvävning.
- Exponera ventrala sidan av musen och våta buken med 70% etanol.
- Använd pincett tag i buken huden och gör ett litet snitt med sax. Skär huden att exponera buken innehåll.
- Identifiera blindtarmen och den proximala tjocktarmen och ta bort dem.
- Placera blindtarmen och proximal tjocktarmen hos en 10 cm petriskål innehåller Dulbecco ändrade Eagle Medium (DMEM) med 500 U / ml penicillin och 500 mikrogram / ml streptomycin (P / S). Skär blindtarmen öppna för att exponera lumen och maskar. Använd pincett plats blindtarmen i en bägare av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och skaka lätt att ta bort avföring.
- Återgå blindtarmen till petriskål med mjukt svängda pincett (Roboz RS-5047) Dra försiktigt ut maskar och placera dem i en brunn i en 6 brunnar som innehåller 5 ml av DMEM + P / S.
- Upprepa denna process för alla möss.
- Sätt 6 brunnar i en Tupperware behållare med en fuktig pappershandduk för att bibehålla fuktigheten och inkubera vid 37 ° C i 4 timmar.
- Efter 4 timmar bort maskar med mjukt svängda pincett och dela upp dem i 2 nya brunnar i sex brunnar som innehåller 5 ml DMEM + P / S. Skörd av innehållet i den ursprungliga väl och lägg i en 15 ml Falcon rör. Spin rör vid 3000 rpm och ta bort och reservera supernatanten som 4 tim antigen (kan användas för cell stimulering efter PBS dialys, där typiska protein avkastningen är 10-20 mg per 20 möss) och återsuspendera ägg som innehåller pelleten i autoklaveras kranvatten.
- Sätt 6 brunnar tillbaka vid 37 ° C över natten. Avlägsna och kassera maskarna. Skörd innehållet i brunnarna i en falk rör och snurra vid 3000 rpm i 5 min. Avlägsna supernatanten och reserven natten antigen (kan användas för Trichuris Ag specifika ELISA antikropp isotyp efter PBS dialys, där typiska protein avkastningen är 10-20 mg per 20 möss) och återsuspendera ägg som innehåller pelleten i autoklaveras kranvatten.
- Kombinera 4 tim och övernattning ägg och filtrera äggen genom 70μm sil för att ta bort överblivna maskar sedan överföra till en 75 cm 2-kolv. Håll kolven i en mörk plats täckt av folie under 6 veckor i rumstemperatur (RT).
- Tvätta ägg i autoklaveras kranvatten och återsuspendera vid 50 livsdugliga ägg i 50 l. För att göra detta, centrifugera ägg vid 3000 rpm i 5 min och återsuspendera i ~ 50 ml sterilt kranvatten. Ta bort 50 l ägg och lägg på en glasplatta. Använda 40x förstoring räkna antalet livskraftiga embryonerade ägg i 50 l. Späd ägg att ge 50 livsdugliga ägg i 50 l. För bilder av livsdugliga ägg, se studien av Kopper och Mansfield 16.
2. Akut infektion av experimentella möss med Trichuris Muris ägg (200 ägg / mus)
- Grundligt resuspendera ägg och ta bort tillräckligt med volym för att behandla antalet möss X 2 (t.ex. för 10 möss tar 200 l x 10 möss x 2 = 4 ml av ägg) och placera dem i en 14 ml snäpplock rör.
- Vänd 14 ml tub snäpplock att blanda. Ta fram 200 l av ägg i 1 ml spruta på en lämplig storlek utfodring nål (för möss som väger 25 gram som vi använde 18 gauge 1 1 / 2 "nålar). I ena handen nackskinnet musen och använda den andra handen administrera ägg via oral sondmatning .
- Vänta 21 dagar.
3. Experimentell skörd
- På dag 21 offra möss med CO 2.
- Samla blod från möss från hjärtat, i en icke-hepariniserat spruta och förvara vid 4 ° C. Följande dag isolera serum och frys vid -20 ° C. Serum kan användas för detektion av Trichuris-specifika IgG-och IgE med ELISA.
- Exponera ventrala sidan av musen och våta buken med 70% etanol.
- Använd pincett tag i buken huden och gör ett litet snitt med sax. Skär huden och underliggande membran avslöja buken innehåll.
- Identifiera tunntarmen, blindtarmen och tjocktarmen. Ta blindtarmen med pincett och dra ut i bukhålan. Med en annan pincett skjuta tunntarmen över till höger utsätta kröslymfknutor (mLNs). Ta bort mLNs försiktigt så att inte skära in i tarmen och lägg i en 15 ml Falcon innehållande 2 ml av media. Om så önskas dessa kan bearbetas och restimulated in vitro (4x10 6 / ml i 1 ml i 24 brunnar med 1 mikrogram / ml αCD3/CD28 eller med 50μg/ml 4h Trichuris Ag) under 72 timmar för cytokin analys med ELISA och intracellulära flåg cytometry.
- Klipp ut blindtarmen och tjocktarmen.
- Använd pincett, tryck ut avföring pellets från distala kolon och placera i en 2 ml Axygen rör. Frys vid -20 ° C. Fekal pellets kan analyseras med Western Blot för uttryck av resistin-liknande molekyl-β (Relm-β).
- Ta bort spetsen på blindtarmen (~ 0,5 cm). För att ta bort avföring hålla blindtarmen spets med pincett och spola med PBS med en 3 ml spruta och 22-gauge nål i en petriskål. Placera i färsk 4% paraformaldehyd i en 5 ml Falcon snäpplock röret. Förvaras vid 4 ° C. Dessa kan paraffininbäddade, sektioneras och monterad på bilderna för histologisk analys.
- Ta bort en bit av proximal kolon (~ 1 cm) för RNA. Sätt provet i 2 ml Axygen rör med 500 l RNAlater. Förvaras vid 4 ° C. Dessa prover kan analyseras för mRNA-uttryck genom qPCR.
- Placera resten av blindtarmen i en märkt petriskål och frys vid -20 ° C.
4. Räkning av Trichuris Muris maskar i blindtarmen
- Ta bort blindtarmen från frysen och placera den i en petriskål med ~ 5 ml vatten.
- Med sax, uppskuren blindtarmen att exponera lumen.
- Håll blindtarmen med pincett och kraftfullt skaka blindtarmen för att ta bort majoriteten av avföring.
- Överföring blindtarmen till en annan petriskål med vatten och med hjälp av mjukt svängda pincett försiktigt skrapa bort IECS den underliggande vävnaden.
- Överför blindtarmen till en ny petriskål med vatten och kraftigt skrapa återstående vävnad med pincett, rippning vävnaden i små bitar.
- Använd en dissekera mikroskop för att räkna alla maskar i alla 3 i petriskålar. När du hittar en mask ta bort den från skålen att säkerställa samma masken inte räknas två gånger. Om maskar är skadad (dvs brutna på mitten) räknas bara tjocka eller tunna ändar för att få en korrekt räknas.
5. Representativa resultat
Den Trichuris Muris infektion modell möjligt för forskare att kvantifiera parasit belastning och systemiska immunsvar, samt att histologiskt undersöka inflammatoriska svaret i distala blindtarmen. När lumen i skördade blindtarmen är utsatt, kan Trichuris maskar räknas upp med hjälp av en dissekera mikroskop (Figur 1A-B). Parametrar för immunitet mot Trichuris även antikroppar isotyp byta till IgG1 (i samband med Th2-typ immunitet) av resistenta djur, och IgG2a (förknippas med Th1-typ immunitet) i mottagliga djur (Figur 1C). Redovisning av pokalen cell-specifikt protein resistin-liknande molekyl-β (Relm-β) är förknippad med clearance av Trichuris och kan detekteras med Western blot-analys (figur 2). Distala delen av blindtarmen kan färgas med perjodsyra-Schiff (PAS) för att bedöma svaren bägare cell och omfattningen av tarminflammation som svar på infektion (figur 3).
Figur 1. Kvantifiering av immunitet mot Trichuris Muris. (A) resistenta (B6) möss utvisa Trichuris Muris efter dag 21 efter infektion. Däremot blir mottagliga (AKR / J) möss kroniskt infekterade med Trichuris, vilket resulterar i parasit etablering. Varje stapel representerar medelvärdet ± SEM från 4-8 djur per grupp. (B) Worms räknas med hjälp av en dissekera mikroskop. Övre panelen visar maskar i isolering, visar nedre panelen maskar i närvaro av IECS och avföring. (C) Trichuris specifika IgG2a titrar bestäms med ELISA av utspätt serum (1:2 utspädning, börjar vid 1:20 spädning och slutar kl 1:2560) på plåtar täckta med utsöndringsorganen Trichuris antigen (O / N Ag, 5 mikrogram / ml). Mottagliga AKR / J möss märkbart högre Trichuris-specifika serum IgG2a än resistenta B6 möss.
Figur 2. Clearance av Trichuris Muris förknippas med uttryck för den pokalen cell-specifikt protein Relm-β 7. Relm-β produktion kan upptäckas av fekal pellets från Trichuris-smittade resistenta (B6), men inte är mottagliga (AKR / J) möss med Western blot-analys. Varje körfält är representativt för ett enskilt djur, (N) = naivt (Tm) = 21-dagars Trichuris infekterade möss.
Figur 3. Histologisk undersökning av distala blindtarmen följande Trichuris infektion. 5-7 ìm delar av distala blindtarmen färgas med PAS. Goblet cellshyperplasi och slem produktion är uppenbara med resistenta (B6) men inte är mottagliga (AKR / J) möss efter Trichuris infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll detaljer en standard hög dos akut Trichuris Muris infektion som kan ändras efter behov av prövaren. Till exempel kan mössen offras och vävnader skördas på olika dagar. Att fastställa att de möss med framgång har etablerat fullt mask börda de kan offras på dag 14, då alla möss bör göra en börda på cirka 200 maskar. Möss kan också smittas i 32 dagar där någon mask upptäcks har nått mognad och skulle stanna hos värd under hela dess liv. Dessutom kan protokollet anpassas till modell kronisk Trichuris Muris infektion. För att göra detta kan den administrerade ägget dosen justeras till en låg dos infektion (ca 30 ägg). Vid denna dos, vanligen resistenta möss misslyckas med att framkalla en skyddande Th2 svar, utan snarare skapa ett Th1 svar och upprätthålla en belastning på ca 20 maskar 17.
En fördel med Trichuris Muris infektionen modell över annan infektion modeller är att i allmänhet är infekterade möss inte uppvisar någon sjuklighet eller dödlighet. Det finns dock faktorer som kan påverka experimentella resultat som forskare bör vara medveten om. Den första faktorn är bakgrunden stam av möss. Som beskrivits i resultaten, C57BL / 6 möss är motståndskraftiga och AKR / J möss är känsliga, och likaså kan andra inavlade stammar har en annan infektion profiler. Därför är det viktigt att forskaren vara medveten om bakgrunden stam av deras möss och använda lämplig kontroll möss. Dessutom kan det finnas mus till mus variation i parasit clearance, så det finns ingen anledning till oro om en del normalt resistenta kontroll möss ha upp till 30 maskar på 21 dagar efter infektion. Vad bra, kommer känsliga möss inte alltid upprätthålla en fullständig 200-count mask börda, men kan variera från cirka 75 till 200 maskar per blindtarmen. Denna variation kan också förklaras med naturlig variation i tarmfloran hos möss inrymt i olika anläggningar.
En faktor som negativt påverkar Trichuris Muris infektion är förekomsten av springmask. Springmask smittar på samma anatomiska plats som Trichuris och framkalla ett immunsvar, som kan förbrylla tolkningen av Trichuris studierna. Dessutom dödar springmask behandling (albendazol, fenbendazol) också Trichuris. I denna experimentella procedur använder vi möss som hålls under specifika-patogenfria förhållanden, och det är ytterst viktigt att experimentella möss hållas springmask fria före och under Trichuris Muris infektion.
Vissa mindre poäng forskare bör vara medveten om:
- Ägg bör bibehållas i vatten, inte PBS.
- Ägg är mycket tunga och därför bör resuspenderas före leverans till varje mus. Även last bara tillräckligt mängd ägg för att infektera en mus i taget, eftersom de kommer bosätta sig i sprutan.
- Några sällsynta stammar visar könsskillnader i smittsamhet, men i de flesta fall kan antingen män eller kvinnor ska användas för Trichuris Muris infektioner.
- Naiva möss kan hållas i samma bur som infekterade möss eftersom det inte finns någon oro för horisontell överföring av infektion med denna modell.
Totalt sett är Trichuris Muris infektion en enkel procedur för att utföra att modeller Th2-beroende immunitet och kan anpassas efter individuella forskares behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Försök på djur har utförts i enlighet med de riktlinjer och regler som anges av University of British Columbia.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research (MSH-95.368, MOP-89.773 och MOP-106.623 till CZ) och Kanada Stiftelsen för innovation. SCM är mottagare av en CIHR / kanadensiska Association of Gastroenterology postdoktorsstipendium. CZ är ett CIHR ny utredare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
- Cliffe, L. J., Grencis, R. K. The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection. Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).
- Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection. J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).
- Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths. Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).
- Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection. J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).
- Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13. J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).
- Owyang, A. M. Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).
- Artis, D. RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).
- Datta, R. Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite. Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).
- Cliffe, L. J. Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion. Science. 308, 1463-1465 (2005).
- Artis, D. New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes. Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).
- Finkelman, F. D. Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models. Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).
- Grencis, R. K. Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection. Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).
- Khan, W. I. Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections. Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).
- Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection. Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).
- Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).
- Kopper, J. J., Mansfield, L. S. Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse. Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).
- Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response. Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).
