Summary
זיהום Trichuris muris הוא מודל מעיים של חסינות Th2 שבו עכברים עמיד ליצור תגובת Th2 מגן עכברים רגישים ליצור תגובה פתולוגית Th1.
Abstract
Trichuris muris הוא פתוגן טבעי של עכברים דומה ביולוגית antigenically למינים של Trichuris כי להדביק בני אדם ובעלי חיים 1. ביצי התולעת ניתנים על ידי gavage אוראלי, בוקעות במעי הדק הדיסטלי, לפלוש לתאי האפיתל במעי (IECs) כי קו מאורות של cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי ועל התבגרות תולעים שחרור ביצים לתוך הסביבה 1. מודל זה הוא כלי רב עוצמה לבחון את הגורמים CD4 + T שליטה עוזר (ה ') בתא ההפעלה, כמו גם שינויים באפיתל המעי. התגובה החיסונית המתרחשת זנים טהורים עמידים, כגון C57BL / 6 BALB / c, מאופיין ציטוקינים Th2 מקוטב (IL-4, IL-5 ו-IL-13) וגירוש של תולעים בזמן Th1 הקשורים ציטוקינים (IL -12, IL-18, IFN-γ) לקדם דלקות כרוניות AKR רגישים מבחינה גנטית / עכברים J 2-6. ציטוקינים Th2 לקדם שינויים פיזיולוגיים אצל microenvironment המעי כולל תחלופה מהירה של IECs, התמיינות תאים הגביע, גיוס ושינויים בחדירות אפיתל והתכווצות שרירים חלקים, אשר כולם היו מעורבים בגירוש תולעת 7-15. כאן אנו פרט פרוטוקול עבור הפצת Trichuris ביצים muris אשר ניתן להשתמש בהם בניסויים הבאים. כמו כן אנו מספקים מדגם ניסיוני הקציר עם הצעות ניתוח שלאחר זיהום. בסך הכל, פרוטוקול זה יספק לחוקרים את הכלים הבסיסיים לביצוע muris זיהום Trichuris העכבר מודל אשר יכול לשמש כדי לענות על שאלות הנוגעות נטייה Th במערכת העיכול, כמו גם פונקציות מפעיל החיסונית של IECs.
Protocol
1. הפצת Trichuris ביצים muris
- כדי ליצור קבוצות חדשות של ביצים Trichuris muris, להדביק 20-30 עכברים immunodeficient (למשל NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NSG) או 129S6/SvEvTac-Rag2 tm1Fwa (RAG2 - / -)) או עכברים רגישים מבחינה גנטית ( למשל. AKR / י) כי הם 6-8 שבועות עם כ 300 ביצים Trichuris muris ידי gavage הפה.
- לאחר 32-35 ימים להקריב את העכברים בחנק CO 2.
- לחשוף את הצד הגחוני של העכבר רטובה את הבטן עם אתנול 70%.
- מלקחיים שימוש לתפוס את עור הבטן לעשות חתך קטן בעזרת מספריים. חותכים את העור כדי לחשוף את תכולת הבטן.
- זהה את cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי, ולהסיר אותם.
- מניחים את cecum ואת המעי הגס הפרוקסימלי של צלחת פטרי המכילה 10 ס"מ השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) עם 500 U / ml פניצילין 500 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין (P / S). חותכים את cecum לפתוח לחשוף את לומן ואת תולעים. בעזרת מלקחיים cecum מקום בכוס של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) וללחוץ בעדינות כדי להסיר את הצואה.
- חזור cecum אל צלחת פטרי באמצעות מלקחיים מעוקל חלקה (Roboz RS-5047) בעדינות לשלוף תולעים למקם אותם היטב של צלחת 6 היטב המכיל 5 MLS ש DMEM + P /
- חזור על תהליך זה עבור כל העכברים.
- שים 6 צלחת היטב במיכל פלסטיק עם מגבת נייר לחה כדי לשמור על לחות לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות.
- לאחר 4 שעות להסיר תולעים באמצעות מלקחיים מעוקל חלקה לפצל אותם לתוך 2 בארות חדשות של צלחת 6 היטב DMEM המכיל 5 מ"ל + P / S. קציר את תוכן היטב את המקום המקורי של צינור 15 בז מ"ל. ספין צינור ב 3000 סל"ד ולהסיר ובמילואים supernatant כמו אנטיגן 4 שעה (יכול לשמש restimulation התא לאחר PBS דיאליזה, שם התשואות חלבון טיפוסי הם 10-20 מ"ג לכל 20 עכברים) ו resuspend ביצה המכילים גלולה במי ברז autoclaved.
- שים את צלחת 6 גם חזרה 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר להיפטר התולעים. קציר את התוכן של בארות לתוך צינור בז ספין בסל"ד 3000 דקות 5. הסר supernatant ובמילואים כמו אנטיגן לילה (ניתן להשתמש Trichuris Ag ELISAs אלוטיפ נוגדן ספציפי לאחר PBS דיאליזה, שם התשואות חלבון טיפוסי הם 10-20 מ"ג לכל 20 עכברים) ו המכילות ביצים resuspend גלולה במי ברז autoclaved.
- שלב 4 שעות וביצים לילה ולסנן את הביצים דרך המסננת 70μm להסיר שאריות תולעים מכן להעביר לתוך בקבוקון 75 ס"מ 2. שמור את הבקבוק במקום חשוך מכוסה בנייר כסף במשך 6 שבועות בטמפרטורת החדר (RT).
- לשטוף ביצים במי ברז autoclaved ו resuspend בגיל 50 ביצים קיימא μl 50. כדי לעשות זאת, צנטריפוגה ביצים בסל"ד 3000 דקות 5 ו resuspend במים 50 מ"ל ~ ברז סטרילי. הסר 50 ביצים μl מקום בשקופית זכוכית. באמצעות הגדלה 40X לספור את מספר הביצים embryonated קיימא μl 50. מדולל ביצים לתת 50 ביצים קיימא μl 50. לקבלת תמונות של ביצי קיימא עיין מחקר שנערך על ידי Kopper ו מנספילד 16.
2. דלקת חריפה של עכברי הניסוי עם Trichuris muris ביצים (200 ביצים / עכבר)
- ביצים resuspend ביסודיות להסיר נפח מספיק כדי לטפל במספר של עכברים X 2 (למשל עבור 10 עכברים לוקחים 200 μl x 10 x 2 = עכברים MLS 4 ביצים) וגם למקם אותם שפופרת 14 מ"ל הצמד כובע.
- הפוך את הצמד 14 מ"ל צינור כובע לערבב. מביא 200 μl של ביצים לתוך מזרק 1 מ"ל על מחט בגודל המתאים האכלה (עבור עכברים במשקל 25 גרם השתמשנו 18 מד 1 1 / 2 "מחטים). בעורפו ב יד אחת על העכבר בעזרת היד השנייה לנהל את הביצים על ידי gavage אוראלי .
- חכה 21 ימים.
3. ניסיוני קציר
- ביום 21 להקריב את העכברים באמצעות ה-CO 2.
- איסוף דם מעכברים ידי לנקב לב, בתוך מזרק ללא heparinized, ולאחסן ב 4 ° C. למחרת לבודד בסרום להקפיא ב -20 ° C. סרום ניתן להשתמש לצורך זיהוי של Trichuris ספציפי IgGs ו IgE על ידי ELISA.
- לחשוף את הצד הגחוני של העכבר רטובה את הבטן עם אתנול 70%.
- מלקחיים שימוש לתפוס את עור הבטן לעשות חתך קטן בעזרת מספריים. חותכים את העור ואת קרום הבסיסי לחשוף את תכולת הבטן.
- זהה את המעי הדק, cecum והמעי הגס. תפוס את cecum עם מלקחיים ולשלוף של חלל הבטן. עם זוג נוסף של מלקחיים לדחוף המעי הדק מעל ימינה לחשוף את בלוטות לימפה mesenteric (mLNs). הסר את mLNs נזהרים שלא לחתוך את המעיים ומכניסים 15 מ"ל בז המכיל 2 MLS של התקשורת. אם תרצה אלה יכולים להיות מעובדים restimulated במבחנה (4x10 6 / מ"ל 1 מ"ל ב 24 צלחות היטב עם αCD3/CD28 מיקרוגרם / מ"ל 1 או עם 50μg/ml 4H Trichuris Ag) עבור 72 שעות לניתוח ציטוקינים על ידי ELISA ו-F תאייםנמוך cytometry.
- חותכים את cecum והמעי הגס.
- בעזרת מלקחיים, לדחוף החוצה כדורי צואה מן המעי הגס הדיסטלי מקום ובכל צינור 2 Axygen מ"ל. להקפיא ב -20 ° C. כדורי צואה ניתן לנתח על ידי כתם המערבי לביטוי של resistin כמו β-מולקולה (RELM-β).
- הסר את הקצה של cecum (~ 0.5 ס"מ). כדי להסיר צואת להחזיק קצה cecum עם מלקחיים ולשטוף עם PBS באמצעות מזרק 3 מ"ל ו - 22-מחט מד בצלחת פטרי. מקום paraformaldehyde 4% טרי צינור 5 מ"ל פלקון כובע הצמד. חנות ב 4 ° C. אלה יכולים להיות מוטבע פרפין, מחולק רכוב על שקופיות לניתוח היסטולוגית.
- הסר חתיכת המעי הגס הפרוקסימלי (~ 1 ס"מ) של RNA. שים מדגם לתוך צינור 2 Axygen מ"ל עם RNAlater 500 μl. חנות ב 4 ° C. דגימות אלו ניתן לנתח ביטוי mRNA על ידי qPCR.
- מניחים את שאר cecum בצלחת פטרי שכותרתו להקפיא ב -20 ° C.
4. ספירת Trichuris muris תולעים cecum
- הסר cecum מהמקפיא ומניחים בצלחת פטרי המכילות ~ 5 מ"ל מים.
- בעזרת מספריים, חותכים לפתוח cecum לחשוף את לומן.
- החזק את cecum עם מלקחיים במרץ לנער את cecum להסיר את מרבית הצואה.
- העברת cecum אל צלחת פטרי אחר המכיל מים באמצעות מלקחיים מעוקל חלק בעדינות לגרד את IECs הרקמה הבסיסית.
- העברת cecum כדי בצלחת פטרי חדשה המכילה מים במרץ לגרד רקמות הנותרים עם מלקחיים, קורעת את הרקמה לחתיכות קטנות.
- שימוש במיקרוסקופ לנתח כדי לספור את כל התולעים בכל 3 של בצלחות פטרי. כפי שאתם מוצאים תולעת להסיר אותו בצלחת כדי להבטיח את התולעת אותו לא נספר פעמיים. אם תולעים פגומים (שבורות כלומר במחצית) לספור רק מסתיים עבה או דק כדי לקבל מספר מדויק.
5. נציג תוצאות
המודל muris Trichuris זיהום מאפשר לחוקרים לכמת נטל טפיל התגובה החיסונית מערכתית, כמו גם בהיסטולוגיה לבחון את התגובה הדלקתית בתוך cecum הדיסטלית. כאשר לומן של cecum שנקטפו חשוף, תולעים Trichuris ניתן המנויים באמצעות מיקרוסקופ לנתח (איור 1A-B). פרמטרים של חסינות Trichuris כוללים גם אלוטיפ נוגדן מעבר IgG1 (המשויך חסינות מסוג Th2) אצל בעלי חיים עמידים, IgG2a (המשויך חסינות מסוג Th1) בבעלי חיים רגישים (תרשים 1C). הביטוי של הגביע תא ספציפי חלבון resistin כמו מולקולות β (RELM-β) מזוהה עם אישור של Trichuris והוא לזיהוי על ידי ניתוח כתם המערבי (איור 2). החלק הדיסטלי של cecum יכול להיות מוכתם תקופתיים חומצה שיף (PAS) כדי להעריך את התא הגביע התגובות והיקף דלקת מעיים בתגובה לזיהום (איור 3).
באיור 1. כימות חסינות Trichuris muris. (א) עמיד (B6) עכברים לגרש muris Trichuris על ידי 21 יום שלאחר זיהום. לעומת זאת, רגישים (AKR / J) עכברים נדבקים כרוני עם Trichuris, וכתוצאה מכך הקמת טפיל. כל עמודה מייצגת את הממוצע ± SEM של 4-8 חיות לכל קבוצה. (ב) תולעים נספרים באמצעות מיקרוסקופ לנתח. הפאנל למעלה מראה תולעים בבידוד, לוח התחתונה מראה תולעים בנוכחות IECs ובצואה. (ג) Trichuris ספציפי titres IgG2a נקבעים על ידי ELISA של נסיוב מדוללת (01:02 דילול, החל מהשעה 1:20 דילול ומסתיים 1:2560) על צלחות מצופה אנטיגן הפרשה Trichuris (O / N Ag, 5 מיקרוגרם / מ"ל). רגישים AKR / י עכברים בעלי רמות גבוהות במיוחד של IgG2a Trichuris ספציפיים בסרום מאשר B6 עכברים עמידים.
איור 2. חיסול של Trichuris muris קשורה ביטוי הגביע תאים ספציפיים לחלבון RELM β-7. RELM-β הייצור ניתן להבחין בין כדוריות צואה מן עמידים Trichuris נגועים (B6), אבל לא רגישים (AKR / J) עכברים ידי ניתוח כתם המערבי. נתיב כל נציג של חיה אחת, (N) = תמים, (TM) = 21 יום Trichuris עכברים נגועים.
איור 3. בדיקה היסטולוגית של זיהום cecum דיסטלי הבאים Trichuris. סעיפים 5-7 מיקרומטר של cecum דיסטלי מוכתם PAS. תא וגביע היפרפלזיה ייצור ליחה ניכרות עמיד (B6), אבל לא רגישים (AKR / J) עכברים הבאים זיהום Trichuris.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה פרטים מנה ברמה גבוהה חריפה Trichuris muris זיהום אשר יכול להיות שונה כפי שנדרש על ידי החוקר. למשל, בעכברים אפשר להקריב ורקמות שנקטפו בימים שונים. כדי לקבוע כי העכברים הקימו בהצלחה נטל תולעת מלא הם יכולים להקריב ביום 14, ובשלב זה כל העכברים צריכים לשאת בנטל של כ 200 תולעים. עכברים יכולים גם להיות נגועים עבור 32 ימים שבהם כל תולעת זוהה תגיע לבגרות יישאר עם מארח למשך חייו. בנוסף, הפרוטוקול ניתן להתאים מודל זיהום כרוני Trichuris muris. כדי לעשות זאת, מנה את הביצה מנוהל ניתן להתאים זיהום במינון נמוך (כ 30 ביצים). במינון זה, בדרך כלל עכברים עמידים להיכשל כדי לגרום תגובה Th2 מגן, אלא ליצור תגובת Th1 ולשמור על נטל של כ 20 תולעים 17.
אחד היתרונות של המודל Trichuris זיהום muris על זיהום מודלים אחרים הוא בכלל עכברים נגועים אינם מציגים כל תחלואה או תמותה. אולם ישנם גורמים אשר יכולים להשפיע על תוצאות הניסוי, כי החוקרים צריכים להיות מודעים. הגורם הראשון הוא זן רקע של העכברים. כפי שמתואר ב תוצאות, עכברים C57BL / 6 הם עמידים AKR / י עכברים רגישים, וכן, כן, זנים טהורים אחרים עשויים להיות פרופילי זיהום שונים. לכן חשוב כי החוקר להיות מודע למתח הרקע של עכברים שלהם ולהשתמש עכברים שליטה המתאים. בנוסף, לא יכול להיות עכבר ל-עכבר וריאציה אישור טפיל כך שאין סיבה לדאגה אם כמה עכברים שליטה עמידים בדרך כלל עד 30 תולעים על זיהום ימים 21 פוסט. כמו כן, העכברים רגישים לא תמיד שומרים על מלוא נטל 200-count תולעת, אבל יכולים לנוע בין כ 75-200 תולעים לכל cecum. וריאציה זו יכולה גם להיות מוסברת על ידי השונות הטבעית צמחיית המעיים של עכברים שוכנו מתקני שונים.
גורם זה משפיע לרעה על זיהום Trichuris muris הוא נוכחותם של מרצעית. ותולעי סיכה להדביק באתר אנטומיים כמו Trichuris ו להשרות תגובה חיסונית יכול לבלבל את הפרשנות של המחקרים Trichuris. יתר על כן, טיפול מרצעית (albendazole, fenbendazole) גם הורג Trichuris. בהליך זה ניסיוני, אנו משתמשים בעכברים אשר נשמרים תחת תנאים מסוימים, הפתוגן חינם, וזה הוא בעל חשיבות עליונה, כי עכברי הניסוי להישמר מרצעית חינם לפני ובמהלך זיהום muris Trichuris.
כמה חוקרים נקודות קטין צריך להיות מודע:
- ביצים יש לשמור במים, לא PBS.
- ביצים הן כבדות מאוד, ולכן צריך להיות resuspended לפני משלוח כל עכבר. כמו כן, לטעון רק נפח מספיק ביצים כדי להדביק עכבר אחד בכל פעם, כפי שהם יסתפקו ב המזרק.
- כמה זנים נדירים להראות ההבדלים בין המינים infectivity אך ברוב המקרים, או זכרים או נקבות יכול לשמש זיהומים Trichuris muris.
- עכברים נאיבי יכול להיות שוכנו באותו כלוב כמו עכברים נגועים שכן אין חשש של העברה אופקית של זיהום עם המודל הזה.
בסך הכל, זיהום Trichuris muris היא תהליך פשוט לביצוע מודלים Th2 תלויי חסינות והוא יכול להיות מותאם אישית כדי להתאים לצרכי החוקרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי האוניברסיטה של קולומביה הבריטית.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (MSH-95368, 89773 ו MOP-MOP-106,623 עד CZ) וקרן קנדה עבור חדשנות. SCM הוא הנמען של האגודה CIHR / הקנדי של אחווה לגסטרואנטרולוגיה דוקטורט. CZ הוא חוקר חדש CIHR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animal Feeding Needles (18 x 1½") | Popper & Sons, Inc. | 7912 | |
| Smooth curved Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5047 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11965 | |
| NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) | Jackson Laboratory | 005557 | These are the mice we used, however, any immunodeficient mice or susceptible strain should work. |
| RNAlater | Qiagen | 76104 | |
| 2 ml tubes | Axygen Scientific | MCT-200-C | |
| 15 ml tubes | Falcon BD | 352096 | |
| 6 well plates | Falcon BD | 353046 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| α-RELMβ antibody | PeproTech Inc | 0694270Rb |
References
- Cliffe, L. J., Grencis, R. K. The Trichuris muris system: a paradigm of resistance and susceptibility to intestinal nematode infection. Adv. Parasitol. 57, 255-307 (2004).
- Else, K. J., Finkelman, F. D., Maliszewski, C. R., Grencis, R. K. Cytokine-mediated regulation of chronic intestinal helminth infection. J. Exp. Med. 179, 347-351 (1994).
- Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Th1 and Th2 cells and immunity to intestinal helminths. Chem. Immunol. 71, 192-208 (1998).
- Bancroft, A. J., McKenzie, A. N., Grencis, R. K. A critical role for IL-13 in resistance to intestinal nematode infection. J. Immunol. 160, 3453-3461 (1998).
- Helmby, H., Takeda, K., Akira, S., Grencis, R. K. Interleukin (IL)-18 promotes the development of chronic gastrointestinal helminth infection by downregulating IL-13. J. Exp. Med. 194, 355-364 (2001).
- Owyang, A. M. Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract. J. Exp. Med. 203, 843-849 (2006).
- Artis, D. RELMβ/FIZZ2 is a goblet cell-specific immune-effector molecule in the gastrointestinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 13596-13600 (2004).
- Datta, R. Identification of novel genes in intestinal tissue that are regulated after infection with an intestinal nematode parasite. Infect. Immun. 73, 4025-4033 (2005).
- Cliffe, L. J. Accelerated intestinal epithelial cell turnover: a new mechanism of parasite expulsion. Science. 308, 1463-1465 (2005).
- Artis, D. New weapons in the war on worms: identification of putative mechanisms of immune-mediated expulsion of gastrointestinal nematodes. Int. J. Parasitol. 36, 723-733 (2006).
- Finkelman, F. D. Cytokine regulation of host defense against parasitic gastrointestinal nematodes: lessons from studies with rodent models. Annu. Rev. Immunol. 15, 505-533 (1997).
- Grencis, R. K. Enteric helminth infection: immunopathology and resistance during intestinal nematode infection. Chem. Immunol. 66, 41-61 (1997).
- Khan, W. I. Modulation of intestinal muscle contraction by interleukin-9 (IL-9) or IL-9 neutralization: correlation with worm expulsion in murine nematode infections. Infect. Immun. 71, 2430-2438 (2003).
- Khan, W. I., Blennerhasset, P., Ma, C., Matthaei, K. I., Collins, S. M. Stat6 dependent goblet cell hyperplasia during intestinal nematode infection. Parasite Immunol. 23, 39-42 (2001).
- Akiho, H., Blennerhassett, P., Deng, Y., Collins, S. M. Role of IL-4, IL-13, and STAT6 in inflammation-induced hypercontractility of murine smooth muscle cells. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 282, 226-2232 (2002).
- Kopper, J. J., Mansfield, L. S. Development of improved methods for delivery of Trichuris muris to the laboratory mouse. Parasitol. Res. 107, 1103-1113 (2010).
- Bancroft, A. J., Else, K. J., Grencis, R. K. Low-level infection with Trichuris muris significantly affects the polarization of the CD4 response. Eur. J. Immunol. 24, 3113-3118 (1994).
