Summary
ووصف طريقة نقل الجينات لعلاج قصور القلب الإقفاري باستخدام نموذج الخنازير من احتشاء عضلة القلب. لدينا وسيلة بسيطة وقابلة للتكرار تمكننا من تقييم فعالية بسهولة نقل الجينات المختلفة مع طريقة بسيطة جدا وقابلة للتكرار.
Abstract
ويجري تطوير مختلف التكنولوجيات الناشئة للمرضى المصابين بقصور في القلب. راسخة التقييمات قبل السريرية ضرورية لتحديد فعاليتها وسلامتها.
العلاج الجيني باستخدام نواقل الفيروسية هي واحدة من أكثر الأساليب واعدة لعلاج أمراض القلب. تسليم الفيروسية من جينات مختلفة مختلفة عن طريق تغيير الجينات الحاملة لديها امكانات لا حصر لها العلاجية.
في هذا الفيديو ، وتقدم العملية الكاملة لنموذج حيواني من خلق فشل القلب تليها نقل الجينات باستخدام نموذج الخنازير. أولا ، يتم إنشاء احتشاء عضلة القلب عن طريق الاغلاق الأمامي الأيسر النازل القريبة الشريان التاجي. إعادة عرض نتائج القلب في فشل القلب المزمن. فريدة من نوعها لنموذجنا هو ندبة كبيرة نوعا ما وهو ما يعكس حقا المرضى الذين يعانون من قصور القلب الذين يحتاجون إلى العلاج شديد العدوانية من أجل تحقيق نتائج إيجابية. احتشاء عضلة القلب بعد إنشاء وتطوير ندبا ، ويتجلى حقنة intracoronary من الفيروس مع التسريب النيتروجلسرين في وقت واحد. لدينا وسيلة حقن يوفر بسيطة وفعالة نقل الجينات مع الجينات المحسنة. وقد أثبت هذا المزيج من احتشاء عضلة القلب نموذجا الخنازير مع فيروس التسليم intracoronary أن تكون منهجية متسقة وقابلة للتكرار ، والذي لا يساعد فقط على اختبار تأثير الجينات الفردية ، ولكن أيضا مقارنة فعالية العديد من الجينات العلاجية كمرشحين.
Protocol
1. احتشاء عضلة القلب خلق
- إناث الخنازير يوركشاير (20kg) من صناعات التكنولوجيا الحيوية الحيوانية (Doylestown ، والسلطة الفلسطينية) هي مرحلة ما قبل العلاج باستخدام Telazol (تلييتامين / zolazepam) (8.0 ملغ / كلغ) والبوبرينورفين (0.6 ملغ).
- وintubated الحيوانات والتهوية ثم مع الأكسجين 100 ٪. يتم الاحتفاظ التخدير العام مع البروبوفول (5-8mg/kg/hr) في جميع أنحاء الداخلي.
- مستعدة للموقع الفخذ مع ايزوبروبيل 70 ٪ تليها بوفيدون اليود. ثقب عن طريق الجلد يتيح الوصول إلى الشرايين والتنسيب للغمد. بعد الإدراج غمد ، تدار 3000-5000 وحدة دولية من الهيبارين الرابع للحفاظ على الوقت لتنشيط تجلط الدم 250-300 ثواني.
- تدار جرعة من الأميودارون بلعة (75 ملغ) عن طريق الحقن العضلي. بدء الحقن في الوريد من حقيبة مل 1000 المالحة مع الأميودارون (75 ملغ) ، الأتروبين (2 ملغ) ، وخلات البوتاسيوم (20 mEq) وحافظت باستخدام معدل 150 مل / ساعة في جميع أنحاء الداخلي.
- A 7 الاب هوكي العصا القسطرة (القلبية ، ميامي ، فلوريدا) متقدمة على الشريان التاجي الأيسر ويتم إجراء تصوير الأوعية التاجية. متقدمة سلك دليل 0.014 بوصة (ابوت ، وبارك ، وايل) في الجزء الأمامي الأيسر الشريان التاجي النازل (LAD). و8 ملم طويلة ، 4.0 ملم VOYAGER الإفراط في سلك متقدمة بالون (ابوت ، وبارك ، وايل) والمتمركزة على LAD القريبة ، ويتم نفخ البالون التاجية إلى 3 أجهزة الصراف الآلي. ويؤكد انسداد LAD بواسطة عائية.
- مع الكهربائي المستمر ومراقبة الدورة الدموية ، والحفاظ على انسداد لمدة 90 دقيقة. عدم انتظام ضربات القلب البطيني الخبيث قد يحدث أحيانا في أول 40 دقيقة ، وفي هذه الحالة التسليم الفوري للصدمات المباشرة الحالية من 200 إلى 300 J J تدار. عادة ما تكون هناك إطارين وقت الذروة من عدم انتظام ضربات القلب ، واحدة في الفترة بين 2 و 10 دقيقة والآخر بين 25 و 35 دقيقة بعد تضخم البالون. الرصد والمتابعة الحثيثة من صدمات الكهربائية الفورية هي المفتاح لاحتشاء عضلة القلب وإنشاء ناجحة ، لأن هناك حالات أكثر من 95 ٪ من الذين يدخلون الرجفان البطيني ضمن الأطر الزمنية المشار إليها. إذا كان يتم تنفيذ إزالة الرجفان فورية ومناسبة ، ومعدل البقاء على قيد الحياة مرتفعة جدا. إذا كان ضغط الدم أقل من 80 مم زئبق قطرات ، ويتم إنجاز تحميل مع حجم التسريب السريع ملحي في الوريد.
- وبددت البالون وتتم إزالة كافة الأجهزة.
- تتم إزالة غمد من شريان الفخذ ، هو حجب التخدير ، ويتم رصد هذا الحيوان خلال فترة الانتعاش. وانخفض ملحي في الوريد مع الأميودارون ، اتروبين والبوتاسيوم خلات التسريب في 50 مل / ساعة وتعطى له بين عشية وضحاها. يدار من الحقن العضلي من Nitroglycerline وFuroscemide. ثم سمح للحيوان لاسترداد واصلت رصد دقيق ECG ما لا يقل عن 3 ساعات.
- وستعطى الاسبرين (200mg) ص لمدة خمسة أيام.
المضاعفات شيوعا أثناء وبعد إجراء احتشاء عضلة القلب وخلق تشريح الشريان التاجي ، ثقب دموي الموقع ، عدم انتظام ضربات القلب ، وفشل القلب. وصقل تقنية ومطلوب رصد شامل لمنع وإدارة هذه المضاعفات.
2. حقن الفيروس
- وتعد هذه الحيوانات كما هو مبين أعلاه في خلق احتشاء عضلة القلب steps1 - 3. وينبغي أن تعطى الجرعة نفسها من الهيبارين لمنع تجلط الدم خلال حقن الفيروس.
- عصا الهوكي 5Fr القسطرة (القلبية ، ميامي ، فلوريدا) متقدمة على الشريان التاجي الأيسر. بعد عائية ، وهما من الأسلاك دليل 0.014 بوصة والمتقدمة ، واحدة في LAD واحدة في الشريان التاجي الأيسر المنعطف (LCX) لتحديد موقف القسطرة.
- ويوجه الدم الشرياني (-20 مل) من القسطرة. لمنع نقص التروية خلال التسريب ، واستخدام نصف الدم المخفف للحل. يختلط الفيروس في الدم مع 10 مل و 20 مل مخففة لمع المالحة. كما يتم تخفيف ما تبقى من 10 مل و 20 مل و تسليم الفيروس المستخدمة المتبقية داخل تجويف القسطرة.
- بدء النتروجليسرين عن طريق الوريد (20 ميكروغرام / دقيقة) عن طريق الوريد الأذن.
- يتم وضع الطرف قسطرة في المسالك القريبة الرئيسي اليسار. ويتم رصد الضغط من خلال قسطرة لضمان أن لا التوتيد القسطرة.
- يتم حقن الفيروس في الدم المختلط (15 مل) من خلال قسطرة خلال 15 دقيقة باستخدام مضخة التسريب في الشريان التاجي الأيسر. بعد 15 دقيقة ، يتم فيها تبادل المحقنة إلى الاحمرار ، واستمر لمدة 10 دقيقة التسريب.
- يتم إصلاح سلك ومعدات قسطرة الشريان التاجي إلى الحق بنفس الطريقة التي الشريان التاجي الأيسر.
- يتم حقن ما تبقى من 5 مل من الدم المختلط مع الفيروس في الشريان التاجي الأيمن لمدة 5 دقائق ثم 10 دقائق من طرد.
3. ممثل القضية
الشكل 1 يبين تصوير البطينات اليسار في 1 الشهر بعد احتشاء عضلة القلب خلق. هو ضعف كبير في جدار البطين الأيسر الاقتراح مع جزء طرد (EF) من31 ٪. الشكل 2 يبين المقاطع العرضية من البطين الأيسر في 1 الشهر. وينظر الى ندبة كبيرة من القاعدة إلى قمة الجدار الأمامي. وEF المتوسط في 1 الشهر بعد احتشاء عضلة القلب في هذا النموذج هي 36 ٪ ومتوسط حجم نهاية الانبساط هو 83 مل ، في حين أن متوسط هذه الحيوان في نفس الحجم من دون احتشاء عضلة القلب هو 68 ٪ و 42 مل ، على التوالي. ويبين الشكل 3 التعبير عن غال بيتا في منطقة البطين الأيسر منطقة الحدود 1 بعد شهر من حقن الغدة المرتبطة بفيروس (2 × 10 12 الجسيمات الدناز resitant من CMV rAAV1 لاك - Z). تم العثور على التعبير المعزز في مجال حقن الفيروس.
الشكل 1. كسر قياس الطرد من تصوير البطينات اليسار 1 شهر احتشاء عضلة القلب بعد خلق. هي متسعة البطين الأيسر إلى 92.5 مل ، وضعف ملحوظ الجدار الأمامي للحركة.
الشكل 2 ، والمقاطع العرضية من البطين الأيسر في 1 الشهر احتشاء عضلة القلب بعد إنشاء ملون بواسطة ثلاثي فينيل كلوريد tetrazolium لتحديد منطقة الندبة. وينظر الى ندبة كبيرة من القاعدة إلى قمة الجدار الأمامي.
الشكل 3. بيتا غال التعبير الناجم عن الغدة المرتبطة بفيروس (2 × 10 12 الجسيمات الدناز المقاومة للCMV rAAV1 لاك - Z). تم العثور على التعبير المعززة على الحدود بين منطقة التجارة احتشاء والأنسجة الطبيعية (1) ، بعد شهر من حقن الفيروس intracoronary. الصورة اليمنى السفلى ويبين سيطرة سلبية ، حيث تم حقن المياه المالحة فقط طبيعية في الشرايين التاجية باستخدام بروتوكول نفسه.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
من بين الأسباب المختلفة لفشل القلب ، نقص تروية هي حتى الآن الأكثر شيوعا في المسببات. للتغلب على هذا المرض الخطير ، ويجري وضع مناهج علاجية مختلفة. مطلوبة التقييمات حذرا من العلاجات قبل أن يمكن لهذه العلاجات واعدة يمكن تطبيقها على العيادات. ولذلك ، وإنشاء نموذج فشل القلب الدماغية التي تمثل الحالات السريرية للمرضى أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات قصور القلب. لدينا نموذج احتشاء عضلة القلب الخنازير يلبي هذه الاحتياجات متعدية.
للحث على فشل القلب احتشاء عضلة القلب خلق ، احتشاء المنطقة بحاجة إلى أن تكون كبيرة. نموذجنا لديه ندبة أكبر مقارنة مع الدراسات السابقة التي استخدمت أيضا احتشاء عضلة القلب اللف نموذج 1. لقد وجدنا أن الأميودارون بالإدارة والحفاظ على ضغط الدم أكثر من 80 مم زئبق خلال انسداد الشريان التاجي هو ضروري لزيادة معدل البقاء على قيد الحياة على حد سواء ومنطقة احتشاء. بينما Isoflurane هو مخدر فعال لهذا الإجراء 1-2 ، وجدنا أنه مع البروبوفول ، يمكن الحفاظ على ارتفاع ضغط الدم. بالإضافة إلى ذلك ، أفادت Isoflurane هو الحصول على مزيد من آثار واقية من القلب مقارنة مع البروبوفول 3 ، وهذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض حجم من احتشاء.
القلب العلاج الجيني هو الآن واحد من أكثر الأساليب واعدة إلى فشل القلب ، وهناك مجموعة متنوعة من الاستراتيجيات لنقل الجينات. قبل كل شيء ، وحقن intracoronary ناقلات فيروسية تحمل الجينات ، هي تقنية بسيطة وأقل تغلغلا. وبذلت محاولات شتى لزيادة التعبير الجيني. وقد وجدت أن غرس مختبرنا النتروجليسرين خلال حقن فيروس يزيد من التعبير الجيني (I. Karakikes ، بحث غير منشور).
وقد أدى نقل الجينات من SERCA2a الغدة المرتبطة باستخدام ناقلات فيروسية في تحقيق نتائج إيجابية في البشر 4. ومن المتوقع إجراء مزيد من التحسينات على العلاج الجيني القلب مع الجينات الحاملة إضافية فضلا عن التحسينات النواقل. لدينا أسلوب التسليم يوفر بسيطة وفعالة نقل الجينات مع الجينات المحسنة ، ويمكن ترجمتها بسهولة في العيادة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
جميع المؤلفين ليس لديهم الجمعيات التجارية التي قد تشكل خطرا على النحو تضارب في المصالح فيما يتعلق المخطوطة.
Acknowledgments
ويؤيد هذا العمل من قبل المؤسسة من خلال شبكة Leducq Caerus (RJH) ، عن طريق R01 NIH HL093183 ، HL088434 ، HL071763 ، HL080498 ، HL083156 وP20HL100396 (RJH). وأيد DL من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية. نود أن نشكر لورين Leonardson لمساعدتها التقنية في هذا المشروع.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
