Summary
虚血性心不全の治療のための遺伝子導入法は、心筋梗塞の豚モデルを使用して記述されます。私たちのシンプルで再現性のある方法は、私たちは容易に非常にシンプルかつ再現可能な方法で様々な遺伝子の転送の有効性を評価することができます。
Abstract
様々な新技術は、心不全患者のために開発されている。十分に確立された前臨床評価は、その有効性と安全性を判断する必要があります。
ウイルスベクターを用いた遺伝子治療は、心臓疾患を治療するための最も有望なアプローチの一つです。キャリアの遺伝子を変えることによりさまざまな遺伝子のウイルス送達は、計り知れない治療能力を持っています。
このビデオでは、遺伝子導入に続いて心不全の作成の動物モデルの完全なプロセスは、豚モデルを使用して表示されます。最初に、心筋梗塞は冠動脈の降順近左前を閉塞することによって作成されます。慢性心不全における心臓リモデリングの結果。我々のモデルに固有の、真に肯定的な成果のための積極的な治療を必要とする重症心不全患者を反映してかなり大きな傷跡です。瘢痕組織の心筋梗塞の創造と発展を経て、ウイルスの冠動脈内注入は、同時ニトログリセリン注入で示されています。私たちの注入法は、強化された遺伝子発現でシンプルかつ効率的な遺伝子導入を提供します。冠動脈内のウイルスの配信と心筋梗塞豚モデルのこの組み合わせは、個々の遺伝子の効果をテストするだけでなく、支援の一貫性と再現性のある方法論、であることが証明さだけでなく、治療薬候補として多くの遺伝子の有効性を比較しました。
Protocol
1。心筋梗塞の作成
- アニマルバイオテクノロジー産業の女性ヨークシャーブタは（20キロ）（ドイルズタウン、PA）Telazol（tiletamine / zolazepam）（8.0 mg / kg体重）およびブプレノルフィン（0.6 mg）を使用してプリ薬用です。
- 動物は挿管し、100％酸素で換気されています。全身麻酔は、プロシージャ全体でプロポフォール（5-8mg/kg/hr）で維持されます。
- 大腿サイトはポビドンヨードに続く70％イソプロピルアルコールで用意されています。経皮的穿刺は、動脈へのアクセスとシースの配置のために用意されています。シース挿入後、ヘパリンの3000から5000 IUは、250〜300秒の活性化凝固時間を維持するためにIVを投与する。
- アミオダロン（75 mg）のボーラス投与は筋肉内に投与される。アミオダロン（75 mg）を、アトロピン（2mg）を、および酢酸カリウム（20 MEQ）で1000 ml生理食塩水バッグの静脈内注入が開始され、プロシージャ全体で150ミリリットル/時の速度を使用して維持されます。
- 7神父ホッケースティックのカテーテルは、（コーディス、マイアミ、フロリダ州）左冠状動脈に高度であり、冠動脈造影が行われます。 0.014インチのガイドワイヤー（アボット、パーク、イリノイ州）は冠状動脈（LAD）を左前に進んでいる。 8 mmの長、4.0 mmのVOYAGERオーバーザワイヤーバルーン（アボット、パーク、イリノイ州）が進んでおり、位置付け近位LADで、冠動脈バルーンは3気圧に膨張される。 LADの閉塞が血管造影によって確認されます。
- 連続的な心電図と血行動態モニタリングで、閉塞は90分間維持されます。悪性心室性不整脈は、時折投与される場合200 Jから300 Jまで直流ショックの即時配信をで、最初の40分以内に発生する可能性があります。通常、不整脈の二つのピークの時間枠、1つの2〜10分、バルーン拡張後に25〜35分の間に他のがあります。フレームが示された時間内に心室細動の入力の95％以上の発生率があるので、入念に監視し、即座に除細動は、成功した心筋梗塞の創造への鍵です。迅速かつ適切な除細動が行われている場合、生存率は非常に高いです。血圧が80 mmHgの下に低下した場合、容積負荷は、急速な静脈内生理食塩水注入で実現されます。
- バルーンが収縮され、すべてのデバイスが削除されます。
- シースは、麻酔が源泉徴収され、大腿動脈から削除され、そして動物は、リカバリ中に監視されます。アミオダロン、アトロピンと酢酸カリウムの点滴と静脈内生理食塩水を50ml /時間で減少し、一晩与えられます。 NitroglycerlineとFuroscemideの筋肉内注射が投与される。その後、動物を回復されており、慎重な心電図モニタリングは少なくとも3時間続ける。
- アスピリン（200mg）をPOは5日間が与えられます。
心筋梗塞の作成手順の実行中および終了後は一般的な合併症は、冠動脈解離、穿刺部位の血腫、不整脈、および心不全です。技術を洗練し、徹底的な監視は、これらの合併症を予防して管理するために必要です。
2。ウイルスのインジェクション
- 上記の心筋梗塞の作成steps1 - 3で示されているように動物が用意されています。ヘパリンの同一投与量は、ウイルスの注入中に血栓症を防ぐために与えられるべきである。
- 5Frホッケースティックのカテーテル（コーディス、マイアミ、FL）は左冠状動脈に進められます。血管造影後、0.014インチのガイドワイヤーの二人は、LADおよびカテーテルの位置を修正するために、左冠動脈回旋枝（LCX）への1つへの1つ進んでいます。
- 動脈血（-20 ml）をカテーテルから引き出される。注入時の虚血を防ぐために、ハーフ希釈した血液は、ソリューションに使用されます。ウイルスは、10 mlの血液と混合し、生理食塩水で20mlに希釈される。残りの10 mlを、20 mlに希釈し、カテーテルの内腔内残存ウイルスを提供するために使用されます。
- 静脈注射用ニトログリセリン（20μgを/分）は耳静脈を介して開始されます。
- カテーテルの先端は、近位左主管に配置されます。カテーテルを介して圧力は、カテーテルが楔されていないことを保証するために監視されます。
- ウイルス混合血液（15ml）を、左冠状動脈に注入ポンプを使用して、15分にわたってカテーテルを介して注入される。 15分後、注射器は、フラッシュに交換され、そして注入は10分間継続しています。
- ワイヤとカテーテルが右冠動脈に左冠状動脈と同じ方法で固定されている。
- ウイルスと混合血液の残りの5mlをフラッシュの10分に続いて5分間右冠動脈に注入されます。
3。代表的なケース
図1は、心筋梗塞の作成後1ヶ月で左室造影を示しています。左心室壁運動が有意の駆出率（EF）と低下している31％であった。図2は、1ヶ月での左心室の断面を示しています。ベースから前壁の頂部に大きな傷が見られます。このモデルでは、心筋梗塞後1ヶ月での平均EFは36％であり、心筋梗塞のない同じサイズの動物のそれらの平均はそれぞれ、68％、42ミリリットルであるのに対し、平均的な拡張末期容積は、83ミリリットルです。図3は、左心室の境界ゾーンの領域におけるβ- galの発現アデノ随伴ウイルス（rAAV1 CMVラック- Zの2 × 10 12 DNアーゼresitant粒子）の注入後1ヶ月を示しています。増強された発現は、ウイルスの注入領域で発見された。
図1。駆出率は心筋梗塞の作成 後1ヶ月左室造影から測定。左心室は92.5ミリリットルに瞳孔が開いていると前壁の動きが大幅に低下します。
瘢痕領域の輪郭を描くためにトリフェニルテトラゾリウムクロライドで染色した心筋梗塞の作成 後1ヶ月での左心室の2断面、 図 。ベースから前壁の頂部に大きな傷が見られます。
図3。アデノ随伴ウイルス（rAAV1 CMVラック- Zの2 × 10 12 DNアーゼ性粒子）により誘導されるβ- gal発現。増強された発現は梗塞及び正常組織、冠動脈内のウイルス注入後1ヶ月の間の国境地帯の領域で発見されています。右下の写真は、生理食塩水は、同じプロトコルを使用して冠状動脈に注入したネガティブコントロールを示しています。
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Discussion
心不全の様々な原因の中で、虚血は、これまでで最も頻繁に病因にすることです。この深刻な病気を克服するために、様々な治療アプローチが開発されている。これらの有望な治療法が診療所に適用することができるされる前に治療法の慎重な評価が必要です。したがって、患者の臨床状態を表す虚血性心不全モデルの確立は、心不全治療薬の開発にとって非常に重要です。私たちの豚心筋梗塞モデルでは、これらの翻訳要件を満たしています。
心筋梗塞を作成することにより、心不全を誘発するために、梗塞領域の大きさでなければなりません。我々のモデルはまた、血管内治療心筋梗塞モデル1を使用する以前の研究に比べて大きな傷を持っています。我々はアミオダロンを投与し、冠動脈閉塞に80 mmHgの上の血圧の維持は生存率と梗塞領域の両方を高めるために不可欠であることを見出した。イソフルランは、この手順1-2の効果的な麻酔薬である一方、我々はプロポフォールと、高い血圧が維持できることがわかった。さらに、イソフルランはプロポフォール3に比べてより多くの心臓保護効果を有することが報告されており、これは心筋梗塞の減少大きさにつながる可能性があります。
心臓の遺伝子治療は現在、心臓の障害に最も有望な手法の一つであり、遺伝子を転送するための様々な方法があります。とりわけ、遺伝子を運ぶウイルスベクターの冠動脈内注入は、シンプルかつ低侵襲技術です。様々な試みが遺伝子発現を高めるために作られています。私たちの研究室では、ウイルスの注入中にニトログリセリンを注入する遺伝子発現（I. Karakikes、未発表）を増加させることを発見した。
アデノ随伴ウイルスベクターを用いたSERCA2aの遺伝子導入は、ヒト4で肯定的な成果をもたらした。心臓の遺伝子治療へのさらなる改良は、追加のキャリアの遺伝子だけでなく、ベクトルの改良が期待されています。私たちの配信方法は、拡張された遺伝子発現でシンプルかつ効率的な遺伝子導入を提供し、容易にクリニックを翻訳することができます。
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Disclosures
すべての著者は原稿に関連して利害の対立としてもたらす可能性は商業的関連を持っていません。
Acknowledgments
この作品は、NIH R01 HL093183、HL088434、HL071763、HL080498、HL083156、そしてP20HL100396（RJH）で、Caerusネットワーク（RJH）を通じてLeducq財団によってサポートされています。 DLは、ドイツ研究財団によってサポートされていました。我々はこのプロジェクトでは彼女の技術支援のためにローレンLeonardsonに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
