Summary
השיטה של העברת גנים לטיפול באי ספיקת לב איסכמית מתואר באמצעות מודל החזירים של אוטם שריר הלב. שיטה פשוטה לשחזור שלנו מאפשר לנו בקלות להעריך את היעילות של העברת גנים שונים בצורה פשוטה מאוד לשחזור.
Abstract
טכנולוגיות מתפתחות שונים מפותחים עבור חולים עם אי ספיקת לב. ומבוססת הערכות פרה נחוצים כדי לקבוע יעילותם ובטיחות.
ריפוי גנטי באמצעות וקטורים ויראליים היא אחת הגישות המבטיחות לטיפול במחלות לב. משלוח ויראלי של גנים שונות על ידי שינוי גנטי המוביל יש פוטנציאל טיפולי עצום.
בסרטון הזה, תהליך מלא במודל חיה של יצירת אי ספיקת לב בעקבות העברת גנים מוצג באמצעות מודל החזירים. ראשית, אוטם שריר הלב נוצר על ידי occluding הקדמי השמאלי היורד הפרוקסימלי לב כלילית. שיפוץ לב תוצאות אי ספיקת לב כרונית. ייחודיות המודל שלנו הוא צלקת גדולה למדי אשר באמת משקף בחולים עם אי ספיקת לב חמורה אשר דורשים טיפול אגרסיבי עבור תוצאות חיוביות. לאחר אוטם שריר הלב יצירה ופיתוח של רקמה צלקתית, זריקה של וירוס intracoronary מודגם עם אינפוזיה ניטרוגליצרין סימולטני. שיטת הזרקה שלנו מספק העברת גנים פשוטה ויעילה עם ביטוי גנים משופרים. שילוב זה של מודל אוטם שריר הלב החזירים עם מסירה וירוס intracoronary הוכיחה להיות מתודולוגיה עקבית לשחזור, אשר מסייע לא רק כדי לבחון את ההשפעה של גנים בודדים, אלא גם להשוות את היעילות של גנים רבים כמועמדים טיפולית.
Protocol
1. שריר הלב אוטם בריאה
- נקבה חזירים יורקשייר (20kg) מן החיות ביוטק תעשיות (Doylestown, PA) הם מראש באמצעות תרופות Telazol (tiletamine / zolazepam) (8.0 מ"ג / ק"ג) ואת עצירות (0.6 מ"ג).
- חיות הן צנרר ומאוורר אז עם 100% חמצן. הרדמה כללית נשמר עם propofol (5-8mg/kg/hr) לאורך ההליך.
- האתר הירך מוכן עם אלכוהול איזופרופילי 70% ואחריו יוד povidone. לנקב מלעורית מספק גישה העורק עבור מיקום נדן. לאחר הכניסה נדן, 3000-5000 IU של הפרין מנוהל IV כדי לשמור על זמן הקרישה של 250-300 מופעל שניות.
- מינון בולוס של amiodarone (75 מ"ג) מנוהל לתוך שריר. מתן תוך ורידי של שקית 1000 מ"ל מלוחים עם amiodarone (75 מ"ג), אטרופין (2 מ"ג), וכן Acetate אשלגן (20 mEq) מופעל ומתוחזק תוך שימוש בשיעור של 150 מ"ל / שעה במשך ההליך.
- 7 Fr מקל הוקי קטטר (Cordis, מיאמי, פלורידה) הוא מתקדם אל העורק הכלילי השמאלי אנגיוגרפיה כלילית מבוצע. חוט 0.014 אינץ' מדריך (אבוט, פארק, אילינוי) הוא התקדם לתוך הקדמי השמאלי היורד לב כלילית (LAD). 8 מ"מ באורך, 4.0 מ"מ וויאג'ר Over-the-תיל בלון (אבוט, פארק, אילינוי) היא מתקדמת מוצב במרחק של LAD הפרוקסימלי, ואת הבלון מנופח הכליליים היא לכספומט 3. חסימה של LAD הוא אושר על ידי הצנתר.
- עם רל מתמשך וניטור hemodynamic, חסימה נשמר במשך 90 דקות. הפרעות קצב הלב ממאירים לעיתים להתרחש בתוך 40 הדקות הראשונות, ובמקרה אספקה מיידית של הזעזועים הנוכחיים ישירות J 200 עד 300 J מנוהלים. בדרך כלל ישנן שתי מסגרות זמן השיא של הפרעות קצב, אחת בין 2 ל 10 דקות ואת השני בין 25 ל 35 דקות לאחר האינפלציה את הבלון. ניטור חרוץ דפיברילציה מיידית הם המפתח ליצירת אוטם שריר הלב מוצלח, שכן יש שכיחות יותר מ -95% להיכנס פרפור חדרים בתוך הזמן המצוין מסגרות. אם דפיברילציה מיידית מתאימה מבוצע, שיעור ההישרדות הוא גבוה מאוד. אם לחץ הדם יורד מתחת 80 מ"מ כספית, עומס נפח מושגת באמצעות עירוי תוך ורידי מהיר מלוחים.
- הבלון הוא מנוכה וכל המכשירים יוסרו.
- נדן יוסר עורק הירך, הרדמה הוא נמנע, ואת חיה היא להשגחה במהלך ההתאוששות. סליין תוך ורידי עם amiodarone, Atropin ו אינפוזיה Acetate אשלגן הוא ירד ב 50 מ"ל / שעה והוא נתון בין לילה. זריקות לשריר של Nitroglycerline ו Furoscemide מנוהל. אז החיה מותר להתאושש זהיר ניטור אק"ג הוא נמשך לפחות 3 שעות.
- (200 מ"ג) אספירין ת.ד. יינתן במשך חמישה ימים.
הסיבוכים השכיחים במהלך ולאחר הליך אוטם שריר הלב הם יצירה לנתיחה כלילית, אתר המטומה לנקב, הפרעות קצב, ואי ספיקת לב. לחדד טכניקה וניטור יסודית נדרשת כדי למנוע ולנהל סיבוכים אלה.
2. הזרקת וירוס
- החיות מוכנים כפי שצוין לעיל ביצירת אוטם שריר הלב steps1-3. מנה זהה של הפרין צריכה להינתן כדי למנוע פקקת במהלך הזרקת וירוס.
- קטטר 5Fr מקל הוקי (Cordis, מיאמי, פלורידה) הוא מתקדם אל העורק הכלילי השמאלי. לאחר הצנתר, שניים 0.014 אינץ' חוטים מדריך מתקדמים, אחד לתוך LAD ואחד לתוך העורק הכלילי השמאלי גרש (LCX) כדי לתקן את המיקום של הקטטר.
- דם עורקי (-20 מ"ל) שאוב הקטטר. כדי למנוע איסכמיה במהלך העירוי, חצוי הדם מדולל משמש פתרון. הווירוס הוא מעורבב עם דם 10 מ"ל מדולל ל 20 מ"ל עם מי מלח. שאר 10 מ"ל מדולל הוא גם 20 מ"ל ומשומשים לספק וירוס שיורית בתוך לומן את הקטטר.
- ניטרוגליצרין תוך ורידי (20 מיקרוגרם / min) הוא התחיל דרך וריד האוזן.
- קצה הצנתר ממוקמת בדרכי הפרוקסימלי הראשי השמאלי. הלחץ דרך הקטטר מנוטר על מנת להבטיח כי הקטטר לא wedging.
- הדם וירוס מעורב (15 מ"ל) מוזרק דרך קטטר במשך 15 דקות באמצעות משאבת אינפוזיה לתוך העורק הכלילי השמאלי. לאחר 15 דקות, המזרק הוא החליף להסמיק, ואת העירוי נמשך במשך 10 דקות.
- חוט A ו קטטר קבוע הם העורקים הכליליים הימני באותה דרך העורקים הכליליים שמאל.
- שאר 5 מ"ל של דם מעורבב עם הנגיף מוזרק לתוך העורק הכלילי הימני למשך 5 דקות לאחר מכן 10 דקות של סומק.
3. נציג מקרה
איור 1 מציג את ventriculography שמאלה חודש 1 לאחר הקמתה אוטם שריר הלב. תנועת השמאל קיר חדרי נפגעת משמעותית עם חלק פליטה (EF) של31%. איור 2 מציג את חתכים של החדר השמאלי בכל חודש 1. צלקת גדולה מהבסיס אל הקודקוד של הקיר הקדמי נתפסת. EF הממוצע לחודש 1 לאחר אוטם בשריר הלב במודל זה הוא 36% ואת נפח סוף דיאסטולי הממוצע הוא 83 מ"ל, ואילו הממוצע של אלו החיה בגודל זהה ללא אוטם שריר הלב הוא 68% ו 42 מ"ל, בהתאמה. איור 3 מראה את הביטוי של גל בטא באזור החדר השמאלי בגבול אזור 1 חודש לאחר הזריקה של הנגיף adeno הקשורים (2 x 10 12 חלקיקים DNAse resitant של rAAV1 CMV Lac-Z). ביטוי משופר נמצא באזור המוזרק וירוס.
באיור 1. שבריר פליטה נמדד ventriculography השמאלי 1 חודש לאחר יצירת אוטם שריר הלב. החדר השמאלי הוא מורחבים עד 92.5 מ"ל ו קדמית תנועה הקיר נפגעת באופן משמעותי.
איור 2. חתכים של החדר השמאלי בכל חודש 1 לאחר הקמתה אוטם שריר הלב, מוכתמת על ידי כלוריד tetrazolium triphenyl להתוות את אזור הצלקת. צלקת גדולה מהבסיס אל הקודקוד של הקיר הקדמי נתפסת.
איור 3. Beta-gal ביטוי הנגרמת על ידי וירוס adeno הקשורים (2 x 10 12 חלקיקים DNAse עמידים של rAAV1 CMV Lac-Z). ביטוי משופר נמצא באזור הגבול בין אזור אוטם לבין הרקמות, 1 חודש לאחר ההזרקה וירוס intracoronary. התמונה הימנית התחתונה מראה את השליטה שלילי, שבו רק מלוחים נורמלי שהוזרק בעורקים הכליליים באמצעות פרוטוקול זהה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בין הגורמים השונים של אי ספיקת לב, איסכמיה היא רחוקה השכיח ביותר באטיולוגיה. כדי להתגבר על מחלה חמורה, גישות טיפוליות שונות מפותחים. הערכות זהירות של טיפולים נדרשים לפני לטיפולים אלה מבטיחים הם יכולים להיות מיושמים על המרפאות. לפיכך, הקמתה של מודל כישלון לב איסכמית המייצג את התנאים הקליניים של חולים הוא קריטי להתפתחות של טיפולים באי ספיקת לב. מודל החזירים האוטם בשריר הלב שלנו עומד בדרישות אלה translational.
כדי לגרום לאי ספיקת לב על ידי יצירת אוטם שריר הלב, אוטם את האזור צריך להיות גדול. במודל שלנו יש צלקת גדולה יותר לעומת מחקרים קודמים אשר גם משמש מודל endovascular שריר הלב אוטם 1. מצאנו כי מתן amiodarone ושמירה על לחץ דם מעל 80 מ"מ כספית במהלך חסימת העורקים הכליליים הינה חיונית הן כדי להגדיל את שיעור ההישרדות ואזור האוטם. בעוד Isoflurane היא הרדמה יעיל בהליך זה 1-2, מצאנו כי עם propofol, לחץ דם גבוה יכול להישמר. בנוסף, Isoflurane דווח כי יותר Cardio-מגן תופעות לעומת propofol 3, ודבר זה עלול להוביל לירידה בגודל של אוטם.
טיפול לב גנים כיום היא אחת הגישות המבטיחות ביותר על כשלים לב, יש מגוון של אסטרטגיות כדי להעביר את הגן. מעל לכל, הזרקת intracoronary של וקטורים ויראליים נושאת את הגן, היא טכניקה פשוטה פחות פולשניות. ניסיונות שונים עשויים להגביר את ביטוי הגנים. המעבדה שלנו מצא כי יציקת ניטרוגליצרין במהלך הזריקה וירוס מגביר את ביטוי הגנים (א Karakikes, לא פורסם).
העברת גנים של SERCA2a באמצעות adeno הקשורים וקטור ויראלי הביא לתוצאות חיוביות בבני אדם 4. שיפורים נוספים על ריפוי גנטי לב צפויים עם גנים מוביל נוסף, כמו גם שיפורים וקטור. שיטת הצגה שלנו מספק העברת גנים פשוטה ויעילה עם ביטוי גנים משופרים, והוא יכול להיות מתורגם בקלות את המרפאה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
כל המחברים אין עמותות מסחרי שעשוי להתחזות לניגוד עניינים בקשר עם כתב היד.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי קרן Leducq דרך הרשת Caerus (RJH), על ידי NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 ו P20HL100396 (RJH). DL נתמך על ידי קרן המחקר הגרמנית. ברצוננו להודות לורן Leonardson לקבלת סיוע טכני שלה בפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
