Summary
Метод переноса генов для лечения ишемической сердечной недостаточности описывается с помощью свиного модели инфаркта миокарда. Наш простой и воспроизводимый метод позволяет легко оценить эффективность различных переводов гена с очень простым и воспроизводимым способом.
Abstract
Различные новые технологии разрабатываются для пациентов с сердечной недостаточностью. Налаженные доклинической оценки необходимы, чтобы определить их эффективность и безопасность.
Генная терапия с использованием вирусных векторов является одним из наиболее перспективных подходов для лечения сердечных заболеваний. Вирусный доставки различных различных генов путем изменения носителя гена неизмеримый терапевтический потенциал.
В этом видео, весь процесс животной модели сердца ошибки создания последующей передачи генов представлена с помощью свиного модели. Во-первых, инфаркт миокарда создается окклюзии проксимальных левой передней нисходящей коронарной артерии. Сердце ремоделирования приводит к хронической сердечной недостаточности. Уникальный для нашей модели является довольно большой шрам, который действительно отражает пациентов с тяжелой сердечной недостаточностью, которые требуют агрессивной терапии для положительных результатов. После инфаркта миокарда создание и развитие рубцовой ткани, внутрикоронарного инъекции вируса продемонстрировали нитроглицерин с одновременным вливанием. Наши инъекционный метод обеспечивает простой и эффективный перенос генов с повышенной экспрессией генов. Эта комбинация инфаркта миокарда свиньи модель с внутрикоронарного доставки вирус оказался последовательным и воспроизводимым методология, которая помогает не только для проверки влияния отдельных генов, но и сравнить эффективность многих генов в качестве терапевтических кандидатов.
Protocol
1. Инфаркт миокарда создания
- Женский свиней Йоркшир (20 кг) из животных биотехнологической промышленности (Doylestown, ПА) уже лекарственное использованием Telazol (tiletamine / zolazepam) (8,0 мг / кг) и бупренорфин (0,6 мг).
- Животные интубированных и вентиляцию 100% кислородом. Общая анестезия поддерживается с Пропофол (5-8mg/kg/hr) на протяжении всей процедуры.
- Бедренной сайт подготовлен при 70% изопропиловый спирт затем повидон йод. Пункция чрескожная обеспечивает доступ к артерии и для оболочки размещения. После вставки оболочки, 3000-5000 МЕ гепарина вводят IV для поддержания активированного времени свертывания в 250-300 секунд.
- Болюсной дозы амиодарона (75 мг) вводят внутримышечно. Внутривенное введение 1000 мл физиологического раствора сумку с Амиодарон (75 мг), атропин (2 мг) и ацетата калия (20 мэкв) запускается и поддерживается использованием расчета 150 мл / ч на протяжении всей процедуры.
- 7 Fr клюшка катетер (Cordis, Майами, Флорида) является передовой для левой коронарной артерии и коронарной ангиографии не выполняется. 0,014-дюймовый проводник (Abbott, Парк, штат Иллинойс) является передовой в левой передней нисходящей коронарной артерии (LAD). 8-мм длиной, 4,0-мм VOYAGER более-провод воздушный шар (Abbott, Парк, штат Иллинойс) является передовой и позиционируется в проксимальных LAD, и коронарной баллонной надувается до 3 атм. Окклюзия ЛАД подтверждается ангиографии.
- При непрерывном ЭКГ и мониторинга гемодинамики, окклюзия поддерживается в течение 90 минут. Злокачественные желудочковых аритмий могут время от времени происходят в течение первых 40 минут, и в этом случае немедленной поставки постоянного тока потрясения от 200 Дж до 300 Дж находятся в ведении. Обычно Есть два пика сроки аритмии, один от 2 до 10 минут, и другие от 25 до 35 минут после шар инфляции. Мониторинг Добросовестный и непосредственная дефибрилляции являются ключом к успешному созданию инфаркт миокарда, поскольку Есть более 95% случаев вхождения фибрилляции желудочков в сроки, указанные. Если немедленное и надлежащее дефибрилляции выполняется, выживаемость очень высока. Если артериальное давление падает ниже 80 мм рт.ст., объем нагрузки осуществляется при быстром внутривенном введении солевой инфузии.
- Спущенный воздушный шар, и все устройства будут удалены.
- Оболочка удаляется из бедренной артерии, анестезия удерживается, и животное отслеживается во время восстановления. Внутривенно солевых с Амиодарон, атропин и калия ацетат инфузии снижается на 50 мл / ч и дается за одну ночь. Внутримышечные инъекции Nitroglycerline и Furoscemide назначается. Затем животных допускается для восстановления и тщательный мониторинг ЭКГ продолжается не менее 3 часов.
- Аспирин (200 мг) ПО будет предоставлена в течение пяти дней.
Общие осложнения во время и после инфаркта миокарда процедуры создания являются коронарные рассечение, гематома места пункции, аритмии и сердечной недостаточности. Совершенствовать технику и тщательного мониторинга, необходимых для профилактики и лечения этих осложнений.
2. Вирус инъекций
- Животных готовят, как указано выше в инфаркт миокарда создания steps1-3. Же доза гепарина должна быть предоставлена для предотвращения тромбоза во время вирус инъекции.
- 5Fr хоккейной клюшки катетер (Cordis, Майами, Флорида) является передовой для левой коронарной артерии. После ангиографии, два из 0,014-дюймовый провода руководстве, передовой, один в LAD и одна в левом огибающей коронарной артерии (LCX), чтобы исправить положение катетера.
- Артериальная кровь (-20 мл) взята из катетера. Для предотвращения ишемии во время вливания, наполовину разбавленной крови используется для решения. Вирус смешать с 10 мл крови и разбавляют до 20 мл физиологического раствора. Оставшиеся 10 мл также разбавляют до 20 мл и используется доставить остаточного вируса в просвет катетера.
- Внутривенный нитроглицерин (20 мкг / мин) запускается через ухо вены.
- Катетера помещен в проксимальных левого главных путей. Давлением через катетер контролироваться для обеспечения того, чтобы катетер не заклинивание.
- Вирус смешанной крови (15 мл) вводят через катетер в течение 15 минут с помощью инфузионного насоса в левой коронарной артерии. Через 15 минут шприц обменять на флеш, и инфузионных продолжают в течение 10 минут.
- Проволока и катетер крепят к правой коронарной артерии так же, как левой коронарной артерии.
- Остальные 5 мл крови смешивается с вирусом вводится в правой коронарной артерии в течение 5 минут, затем 10 минут флеш.
3. Представитель дело
На рисунке 1 показана левая вентрикулография через 1 месяц после инфаркта миокарда создания. Левого движения стенки желудочка значительно нарушенной с фракцией выброса (ФВ) в31%. На рисунке 2 показаны сечения левого желудочка на 1 месяц. Большой шрам от основания к вершине передней стенки не наблюдается. Средний EF через 1 месяц после инфаркта миокарда в этой модели составляет 36%, а средний конечного диастолического объема составляет 83 мл, в то время как средняя из тех же размеров животного без инфаркта миокарда составляет 68% и 42 мл соответственно. На рисунке 3 показана экспрессия бета-гал в левой части пограничной зоны желудочка через 1 месяц после инъекции адено-ассоциированные вирусы (2 х 10 12 ДНКазы устойчивы частиц rAAV1 ЦМВ Лак-Z). Повышенной экспрессии был найден в области инъекции вируса.
Рисунок 1. Фракция выброса измеряется от левого вентрикулография 1 месяц после инфаркта миокарда создания. Левый желудочек расширенные до 92,5 мл и переднего движения стенки значительно ухудшиться.
Рисунок 2. Сечения левого желудочка через 1 месяц после инфаркта миокарда создания, окрашивали трифенил хлорида тетразолия очертить шрам области. Большой шрам от основания к вершине передней стенки не наблюдается.
Рисунок 3. Бета-гал выражение индуцированного адено-ассоциированные вирусы (2 х 10 12 ДНКазы устойчивые частицы rAAV1 ЦМВ Лак-Z). Повышенной экспрессии находится в районе пограничной зоне между миокарда и нормальной тканью, через 1 месяц после инъекции вируса внутрикоронарного. Правый нижний рисунок показывает отрицательный контроль, где только физиологический раствор вводили в коронарных артериях, используя тот же протокол.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Среди различных причин сердечной недостаточности, ишемии на сегодняшний день является наиболее частой в этиологии. Для преодоления этого серьезного заболевания, различные терапевтические подходы в настоящее время разрабатываются. Тщательная оценка терапии необходимы, прежде чем эти перспективные методы лечения могут быть применены к клиник. Таким образом, создание модели ишемической сердечной недостаточности, которая представляет клинических условиях больных имеет решающее значение для развития методов лечения сердечной недостаточности. Наши свиньи инфаркта миокарда модель отвечает этим требованиям поступательного.
Для стимулирования сердечной недостаточности путем создания инфаркт миокарда, инфаркт области должны быть большими. Наша модель имеет больший рубец по сравнению с предыдущими исследованиями, которые также используются эндоваскулярные инфаркт миокарда модель 1. Мы обнаружили, что прием амиодарона и поддержания артериального давления более чем на 80 мм рт.ст. во время коронарной окклюзии необходимо увеличить как выживаемость и инфаркта области. Хотя изофлюрана является эффективной анестезии для этой процедуры 1-2, мы обнаружили, что с Пропофол, более высокое кровяное давление может быть сохранен. Кроме того, изофлюрана, как сообщается, более сердечно-защитный эффект по сравнению с Пропофол 3, и это может привести к снижению размера инфаркта.
Сердечная генная терапия является одним из наиболее перспективных подходов к сердцу неудачи, и Есть различные стратегии для передачи гена. Прежде всего, внутрикоронарного инъекции вирусных переносчиков генов, является простым и менее инвазивные методики. Различные попытки увеличить экспрессию генов. Наша лаборатория обнаружила, что вливание нитроглицерина во время инъекции вируса увеличивает экспрессию генов (И. Karakikes, не опубликовано).
Перенос гена из SERCA2a использованием адено-связанный вирусный вектор привело к положительным результатам в организме человека 4. Дальнейшие улучшения сердечной генной терапии ожидаются дополнительные гены носителя, а также вектор уточнений. Наш способ доставки обеспечивает простой и эффективный перенос генов с повышенной экспрессией генов, и может быть легко переведена в клинику.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Все авторы не имеют коммерческие объединения, которые могут представлять, как конфликт интересов в связи с рукописью.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке Фонда Leducq через Caerus сети (RJH), по НИЗ R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 и P20HL100396 (RJH). DL была поддержана Немецкого исследовательского фонда. Мы хотели бы поблагодарить Лорен Leonardson за техническую помощь в этом проекте.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
