Summary
Um método de transferência de genes para o tratamento da insuficiência cardíaca isquêmica é descrito usando um modelo de suínos de infarto do miocárdio. Nosso método simples e reprodutível nos permite facilmente avaliar a eficácia da transferência de genes diferentes com uma maneira muito simples e reprodutível.
Abstract
Várias tecnologias emergentes estão sendo desenvolvidos para pacientes com insuficiência cardíaca. Bem estabelecida avaliações pré-clínicos são necessários para determinar sua eficácia e segurança.
Terapia gênica usando vetores virais é uma das abordagens mais promissoras para o tratamento de doenças cardíacas. Entrega de vários genes virais diferentes, alterando o gene transportador tem potencial terapêutico imensurável.
Neste vídeo, o processo completo de um modelo animal de criação de insuficiência cardíaca seguida de transferência de genes é apresentado através de um modelo suína. Primeiro, infarto do miocárdio é criado por oclusão da descendente anterior proximal da artéria coronária. Coração resultados remodelação na insuficiência cardíaca crônica. Exclusivo para o nosso modelo é uma cicatriz bastante grande que reflete verdadeiramente pacientes com insuficiência cardíaca grave que necessitam de terapia agressiva para resultados positivos. Após a criação infarto do miocárdio eo desenvolvimento de tecido cicatricial, uma injeção intracoronariana de vírus é demonstrado com a infusão de nitroglicerina simultânea. Nosso método de injeção proporciona a transferência de genes simples e eficiente, com reforço da expressão genética. Esta combinação de um modelo de infarto do miocárdio suína com entrega vírus intracoronário tem provado ser uma metodologia consistente e reprodutível, o que contribui não só para testar o efeito do gene individual, mas também comparar a eficácia de muitos genes como candidatos terapêuticos.
Protocol
1. Infarto do miocárdio criação
- Porcas Yorkshire (20 kg) de animais Biotech Industries (Doylestown, PA) são pré-medicados com Telazol (tiletamina / zolazepam) (8,0 mg / kg) e buprenorfina (0,6 mg).
- Os animais são intubados e ventilados com oxigênio a 100%. Anestesia geral é mantida com propofol (5-8mg/kg/hr) durante todo o procedimento.
- O site femoral é preparada com 70% de álcool isopropílico seguido de iodopovidona. A punção percutânea fornece acesso à artéria e para colocação do introdutor. Após a inserção da bainha, 3000-5000 UI de heparina é administrada IV para manter um tempo de coagulação ativado de 250-300 segundos.
- Uma dose de bolus de amiodarona (75 mg) é administrada por via intramuscular. Injeção intravenosa de um saco de 1000 ml salina com amiodarona (75 mg), atropina (2 mg) e acetato de potássio (20 mEq) é iniciado e mantido usando uma taxa de 150 ml / h durante todo o procedimento.
- A 7 Fr cateter hockey-stick (Cordis, Miami, FL) é avançado até a artéria coronária esquerda e uma angiografia coronária é realizada. Um fio-guia 0,014 polegadas (Abbott, Park, IL) é avançado para a descendente anterior esquerda da artéria coronária (LAD). De 8 mm de comprimento, 4,0 mm VOYAGER over-the-wire balão (Abbott, Park, IL) é avançado e posicionado no LAD proximal, eo balão é inflado coronária a 3 atm. Oclusão da artéria descendente anterior é confirmada por angiografia.
- Com eletrocardiograma contínuo e monitorização hemodinâmica, a oclusão é mantida por 90 minutos. Arritmias ventriculares malignas podem, ocasionalmente, ocorrem nos primeiros 40 minutos, caso em que a entrega imediata de choques diretos atual de 200 J a 300 J são administrados. Normalmente existem dois prazos de pico de arritmia, uma entre 2 e 10 minutos, ea outra entre 25 e 35 minutos após a insuflação do balão. Monitoramento diligente e desfibrilação imediata são a chave para a criação do infarto do miocárdio bem sucedida, uma vez que há incidência de mais de 95% de entrar fibrilação ventricular dentro do tempo indicado frames. Se a desfibrilação imediata e apropriada é realizada, a taxa de sobrevivência é muito elevada. Se a pressão arterial cai abaixo de 80 mmHg, o volume de carga é realizada com a infusão intravenosa rápida de solução salina.
- O balão é desinflado e todos os dispositivos são removidos.
- A bainha é removido da artéria femoral, a anestesia é retido, eo animal é monitorado durante a recuperação. Salina intravenosa com amiodarona, atropina e infusão de acetato de potássio é diminuída em 50 ml / hr e é dada durante a noite. Uma injeção intramuscular de Nitroglycerline e Furoscemide é administrada. Em seguida, o animal é permitido para se recuperar e monitorização do ECG é cuidado continuado por pelo menos 3 horas.
- Aspirina (200mg) PO será dada durante cinco dias.
Complicações comuns durante e após o procedimento infarto do miocárdio criação são dissecção coronariana, hematoma local da punção, arritmia e insuficiência cardíaca. A técnica de refinar e monitorização rigorosa é necessária para prevenir e gerir essas complicações.
2. Injeção de vírus
- Os animais são preparados como indicado acima na criação infarto do miocárdio steps1-3. A mesma dose de heparina deve ser dada à prevenção de trombose durante a injeção de vírus.
- Um cateter vara 5Fr hockey (Cordis, Miami, FL) é avançado até a artéria coronária esquerda. Após a angiografia, dois fios de 0,014 polegadas guia são avançados, um na ADA e uma para a artéria coronária circunflexa esquerda (CX) para fixar a posição do cateter.
- Arterial (-20 ml) é retirada do cateter. Para evitar a isquemia durante a infusão, a metade do sangue diluído é usado para a solução. O vírus é misturada com 10 ml de sangue e diluído em 20 ml de solução salina. Os restantes 10 ml também é diluído para 20 ml e usado entregar vírus residual no lúmen do cateter.
- Nitroglicerina intravenosa (20 mg / min) é iniciado através da veia da orelha.
- A ponta do cateter é colocado no trato esquerdo proximal principal. A pressão através do cateter é monitorado para garantir que o cateter não é cunha.
- O sangue vírus misto (15 ml) é injetado através do cateter mais de 15 minutos, utilizando uma bomba de infusão na artéria coronária esquerda. Após 15 minutos, a seringa é trocado para o flush, e infusão é continuada por 10 minutos.
- Um fio e um cateter são fixados em artéria coronária direita da mesma forma que artéria coronária esquerda.
- Os restantes 5 ml de sangue misturado com o vírus é injetado na artéria coronária direita, durante 5 minutos, seguida de 10 minutos de flush.
3. Caso representante
A Figura 1 mostra a ventriculografia esquerda em 1 mês após a criação infarto do miocárdio. O movimento da parede ventricular esquerda é significativamente prejudicada com fração de ejeção (EF) de31%. A Figura 2 mostra as seções transversais do ventrículo esquerdo em um mês. Uma grande cicatriz da base para o ápice da parede anterior é visto. A EF média de um mês após infarto do miocárdio neste modelo é de 36% eo volume final médio diastólica é de 83 ml, enquanto a média daqueles em que o animal do mesmo tamanho sem um infarto do miocárdio é de 68% e 42 ml, respectivamente. A Figura 3 mostra a expressão da beta-gal, na esquerda da área ventricular zona de fronteira um mês após a injeção de adeno-associated virus (2 x 10 12 partículas de DNAse Resistentes rAAV1 CMV Lac-Z). Uma expressão maior foi encontrado na área injetada vírus.
Figura 1. Fração de ejeção medida a partir ventriculografia esquerda um mês após a criação do infarto do miocárdio. Ventrículo esquerdo é dilatado para 92,5 ml e movimento da parede anterior é significativamente prejudicada.
Figura 2. As secções transversais do ventrículo esquerdo em 1 mês após a criação do infarto do miocárdio, manchado por cloreto de trifenil tetrazólio para delinear a área da cicatriz. Uma grande cicatriz da base para o ápice da parede anterior é visto.
Figura 3. Beta-gal expressão induzida pela adeno-associated virus (2 x 10 12 partículas DNAse resistentes de rAAV1 CMV Lac-Z). Uma expressão maior é encontrado na área de zona de fronteira entre o infarto eo tecido normal, um mês após a injeção do vírus intracoronário. Imagem inferior direita mostra o controle negativo, onde somente soro fisiológico foi injetado nas artérias coronárias, utilizando o mesmo protocolo.
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Discussion
Entre as várias causas de insuficiência cardíaca, isquemia é de longe o mais freqüente na etiologia. Para superar esta grave doença, várias abordagens terapêuticas estão sendo desenvolvidas. Avaliações mais criteriosas de terapias são necessárias antes que essas terapias promissoras estão podem ser aplicados para as clínicas. Portanto, o estabelecimento de um modelo de insuficiência cardíaca isquêmica que representa as condições clínicas dos pacientes é fundamental para o desenvolvimento de terapias insuficiência cardíaca. Nosso modelo de infarto do miocárdio suína atende a esses requisitos de translação.
Para induzir insuficiência cardíaca através da criação de um infarto do miocárdio, a área de infarto precisa ser grande. Nosso modelo tem uma cicatriz maior em comparação com estudos anteriores que também usou um modelo de infarto do miocárdio endovascular 1. Nós descobrimos que a administração de amiodarona e manter a pressão arterial acima de 80 mmHg durante a oclusão coronária é essencial para aumentar a taxa de sobrevivência e da área de infarto. Enquanto isoflurano é um anestésico eficaz para este procedimento 1-2, descobrimos que com Propofol, aumento da pressão arterial pode ser mantida. Além disso, isoflurano é relatado para ter mais cardio-efeitos protetores em comparação com Propofol 3, e isso poderia levar a uma diminuição das infarto.
Cardíaco da terapia genética é agora uma das abordagens mais promissoras para insuficiência cardíaca, e há variedade de estratégias para transferir o gene. Acima de tudo, a injeção intracoronariana de vetores virais carregando um gene, é uma técnica simples e menos invasivo. Várias tentativas são feitas para aumentar a expressão do gene. Nosso laboratório descobriu que a infusão de nitroglicerina durante a injeção do vírus aumenta a expressão gênica (I. Karakikes, inédito).
Transferência de genes de SERCA2a usando adeno-associado do vetor viral resultou em resultados positivos em humanos 4. Novas melhorias para a terapia genética cardíaca são esperados com genes transportadora adicionais, bem como refinamentos vetor. Nosso método de entrega fornece transferência de genes simples e eficiente, com reforço da expressão genética, e pode ser facilmente traduzido da clínica.
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Disclosures
Todos os autores não têm associações comerciais que podem se apresentar como um conflito de interesses em conexão com o manuscrito.
Acknowledgments
Este trabalho é apoiado pela Fundação Leducq através da rede Caerus (rjh), pelo NIH R01 HL093183, HL088434, HL071763, HL080498, HL083156 e P20HL100396 (rjh). DL foi apoiada pela Fundação Alemã de Pesquisa. Gostaríamos de agradecer a Lauren Leonardson por sua assistência técnica neste projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Telazol | Fort Dodge Animal Health | 0856-9050-49 | |
| Propofol | APP Pharmaceuticals | 63323-270-20 | |
| Heparin | APP Pharmaceuticals | 63323-540-11 | |
| Amiodarone | APP Pharmaceuticals | 63323-616-03 | |
| Atropin Sulfate | Med-Pharmex | 54925-063-10 | |
| Potassium acetate | American Regent Inc. | 2053-25 | |
| Nitroglycerine | American Regent Inc. | 4810-25 | |
| Salix (Furosemide) | Intervet Inc. | 710461 | |
| 5 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 556-278-0L | |
| 7 Fr Hockey stick catheter | Cordis | 778-278-00 | |
| Coronary wire | Abbott Laboratories | 1044588 | |
| Coronary balloon | Abbott Laboratories | 1009447-08 | |
| 8Fr sheath | Terumo Medical Corp. | RSS801 |
References
- Perez de Prado, A. Closed-chest experimental porcine model of acute myocardial infarction-reperfusion. J Pharmacol Toxicol Methods. 60, 301-306 (2009).
- Angeli, F. S. Left ventricular remodeling after myocardial infarction: characterization of a swine model on beta-blocker therapy. Comp Med. 59, 272-279 (2009).
- Urdaneta, F., Lobato, E. B., Kirby, D. S. &, Sidi, A. Treating myocardial stunning randomly, with either propofol or isoflurane following transient coronary occlusion and reperfusion in pigs. Ann Card Anaesth. 12, 113-121 (2009).
- Jaski, B. E. Calcium upregulation by percutaneous administration of gene therapy in cardiac disease (CUPID Trial), a first-in-human phase 1/2 clinical trial. J Card Fail. 15, 171-181 (2009).
