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Bioengineering

और अंडाशय Oviducts के तीन आयामी अंग संस्कृति के लिए Alginate Hydrogels

Published: June 20, 2011 doi: 10.3791/2804
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, University of Illinois at Chicago
* These authors contributed equally

Summary

उनके तीन आयामी संदर्भ में सामान्य कोशिकाओं की संस्कृति जल्दी सेलुलर परिवर्तन और tumorigenesis के लिए आवश्यक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक वैकल्पिक विधि का प्रतिनिधित्व करता है. इस विधि के लिए सामान्य डिम्बग्रंथि और oviductal कोशिकाओं को विकसित करने के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर के गठन में जल्दी घटनाओं का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

Protocol

1. डिम्बग्रंथि विच्छेदन और ऊतक अलगाव

  1. सोडियम alginate की एक 0.5% (w / v) समाधान तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण से तैयार 5 पहले से वर्णित, बाँझ पीबीएस और 37 तक गर्मी डिग्री सेल्सियस का उपयोग उलटा या कमाल द्वारा मिक्स, लेकिन भंवर नहीं है. 1 मिलीलीटर सिरिंज में एक 25 जी सुई के साथ alginate ड्रा और 37 में बनाए रखने डिग्री सेल्सियस
  2. Crosslinking ऊतक encapsulation पर alginate और 37 के लिए गर्म डिग्री सेल्सियस के लिए 10mm बाँझ CaCl 2 समाधान की तैयारी
  3. संस्कृति (αMEM + 5 इकाइयों पेनिसिलिन और 5 स्ट्रेप्टोमाइसिन / μg मिलीलीटर) मध्यम प्रति में अच्छी तरह से एक 24 प्रत्येक प्रयोग के लिए अच्छी तरह से थाली के 1ml तैयार. संस्कृति के माध्यम में विभिन्न दवाओं, पेप्टाइड्स, या वायरस शामिल हैं. अंग encapsulation के पहले अभिकर्मक के लिए, 2000 Lipofectamine और चार घंटे के लिए प्लास्मिड डीएनए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊतक सेते
  4. जानवर से अंगों को काटना, किसी भी वसा या अवशिष्ट ऊतक निकालने के लिए, धीरे बर्सा अंडाशय आसपास झिल्ली खींच, और चार टुकड़ों में अंग bisecting द्वारा अंडाशय या oviduct में कटौती. पशु सीओ 2 ग्रीवा अव्यवस्था से पीछा asphyxiation द्वारा euthanized थे. Oviduct के लिए, धीरे से अलग खींच जोड़ने झिल्ली और विपरीत दिशाओं में काटने से पहले संदंश का उपयोग ट्यूब की छोर को विस्तार देने के द्वारा ऊतक खुलना.
  5. एक निष्फल जाल फाइबर पर एक एकल alginate छोटी बूंद (~ 1-3 μL) रखें.
  6. बाँझ संदंश का प्रयोग, alginate छोटी बूंद और संदंश या एक बाँझ सुई का उपयोग करते हुए छोटी बूंद केंद्र में अंग का एक टुकड़ा ले जाएँ.
  7. बाँझ संदंश के साथ जाल फाइबर लोभी और यह उल्टा मोड़ गुरुत्वाकर्षण एक फांसी ड्रॉप में alginate मजबूर करने के लिए अनुमति देने के द्वारा अंग टुकड़ा (organoid) युक्त छोटी बूंद उलटें.
  8. एक 10cm पेट्री 10mm CaCl 2 समाधान युक्त इतना है कि ड्रॉप समाधान में गिर जाता है पकवान के किनारे पर संदंश ठोकर.
  9. 2 मिनट के लिए सेते हैं, बाँझ है pores युक्त संस्कृति माध्यम में अतिरिक्त 10mm 2 CaCl और हस्तांतरण रिहाई चम्मच के साथ हटा दें . चार alginate जैल के लिए एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति के माध्यम युक्त थाली की एक अच्छी तरह से एक में स्थानांतरित किया जा सकता है है है. एक निर्धारित समय अवधि के लिए संस्कृति.

2. Alginate और कोशिकाओं के संग्रह की गिरावट

  1. Alginate जेल के solubilization के लिए, 37 लेबोविट्ज़ एल-15 मीडिया में भंग ° 30 मिनट के लिए सी या जब तक जेल पूरी तरह भंग है alginate (3.4 मिलीग्राम / एमएल) lyase में संस्कृतियों सेते हैं.
  2. Alginate lyase से ऊतक निकालें.
  3. OSE के संग्रह के लिए, 1 8 घंटे के लिए लेबोविट्ज़ एल 15 मीडिया में 500 collagenase की इकाइयों के साथ organoid सेते हैं . 2 1 मिनट के लिए मध्यम सत्ता पर दूसरी दालों (2 सेकंड भंवर और 2 आराम सेकंड), 1 1 मिनट के लिए दूसरी दालों (1 सेकंड भंवर और 1 सेकंड बाकी) द्वारा बाद में भंवर. अंग टुकड़े ताजा बाँझ microcentrifuge ट्यूब में microcentrifuge ट्यूब और विंदुक सतह पर तैरनेवाला के नीचे गिर करने के लिए चलो. 3 मिनट 3000 आरपीएम पर गोली डिम्बग्रंथि सतह उपकला अपकेंद्रित्र.
  4. ट्यूबल उपकला के संग्रह के लिए, ट्यूब लंबाई में कटौती और जगह 5 पेनिसिलिन और 5 μg / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन और 4% (v / v) FBS इकाइयों के साथ DMEM में ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर. 3-5 दिनों में, कोशिकाओं "क्रॉल" ट्यूबल stroma के बाहर और ऊतक संस्कृति plastic9 पर विकसित.

3. Alginate आयल वर्गों के लिए समझाया अंग संस्कृतियों का निर्धारण

  1. चयनित समय बिंदु पर संस्कृति के माध्यम से समझाया मनका alginate लीजिए.
  2. Recrosslink alginate बाँझ 10mm CaCl 2 समाधान में दो मिनट के लिए संस्कृति को छोड़ने के द्वारा जेल ठोस बनाना .
  3. 2% 50 मिमी sucrose, 10 मिमी 2 CaCl और 50 मिमी सोडियम cacodylate युक्त paraformaldehyde में alginate समझाया अंग ठीक करने के लिए सुनिश्चित करें कि जेल ठोस रहता है और निर्धारण के दौरान पूरी तरह से ऊतक encapsulates.
  4. ऊतक प्रसंस्करण के बाद, आयल और सूक्ष्म तक्षणी 5 सुक्ष्ममापी वर्गों उत्पन्न करने के साथ खंड में संपूर्ण अंग alginate समझाया संस्कृति टुकड़ा एम्बेड.
  5. alginate और भंग कर दिया जाएगा स्लाइड से हटा अगर आधारित प्रतिजन पुनर्प्राप्ति गर्मी के कारण immunohistochemistry प्रदर्शन. alginate रहना और hematoxylin और eosin धुंधला खड़े तहत eosin लिए दाग होगा.

4. प्रतिनिधि परिणाम:

अंडाशय और oviduct की एक तीन आयामी अंग संस्कृति का एक उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है. अंडाशय अलग आकार के टुकड़ों में काटा जा सकता है, और OSE पैदा करना और सतह है कि स्केलपेल के साथ चीरा से घायल हो गया था की मरम्मत करने के लिए ओर पलायन. इस प्रक्रिया के दौरान, अंतर्निहित stroma के सापेक्ष OSE के सही ओरिएंटेशन, अंडाशय encapsulating OSE के साथ बनाए रखा है. चित्रा 2 में दिखाया गया है, आधे में कटौती अंडाशय के OSE अंडाशय अधिक पूरी तरह से encapsulate के रूप में तिमाहियों या eighths में कटौती अंडाशय की तुलना में. डिम्बग्रंथि के घाव की मरम्मतसतह पूरे अंडाशय के संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है और कैसे ovulation और सतह मरम्मत डिम्बग्रंथि सतह परिवर्तन लाती है पर प्रकाश डाला सकता है.

प्रयोग के endpoint आवश्यक है कि सूचना पर निर्भर करता है. ऊतक वास्तुकला, सेलुलर आकारिकी, और विशिष्ट सेलुलर वृद्धि दर को आसानी से आयल वर्गों का उपयोग निगरानी कर रहे हैं. उदाहरण के लिए, डिम्बग्रंथि सतह उपकला के एक एकल परत सीरम मुक्त αMEM में संवर्धन के बाद 7 दिनों (चित्रा 3A) के लिए मनाया जाता है, जबकि 5 / 7 दिनों के लिए मिलीलीटर इंसुलिन μg के अलावा डिम्बग्रंथि उपकला और सतह की कई परतों के गठन की hyperproliferation लाती कोशिकाओं (चित्रा 3B). संस्कृतियों के लिए 10 सुक्ष्ममापी 24 घंटा का निर्धारण करने के लिए पहले एक अंतिम एकाग्रता में bromodeoxyuridine जोड़कर, कोशिकाओं के प्रसार (इनसेट 3A और 3B) मापा जा सकता है. सीरम मुक्त αMEM में बनाए रखा संस्कृतियों के लिए, OSE के 3-5% लगभग 24 घंटा लेबलिंग अवधि (इनसेट 3A) के दौरान प्रसार से गुजरना है, जबकि granulosa कोशिकाओं का एक बड़ा प्रतिशत पैदा. संस्कृति मीडिया के लिए इंसुलिन के अलावा कुल OSE का लगभग 30% (इनसेट 3B) OSE proliferating का प्रतिशत बढ़ जाती है. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के immunofluorescence मानक माइक्रोस्कोपी के साथ alginate जेल के माध्यम से कल्पना की सीडीएनए अभिकर्मक (चित्रा 3C) के बाद किया जा सकता है. जबकि alginate अंग संस्कृति और डिम्बग्रंथि सतह उपकला और प्राथमिक रोम के विकास और विश्लेषण के लिए प्रदान करता है, यह उल्लेखनीय है कि परिपक्व, माध्यमिक रोम इस संस्कृति प्रणाली (चित्रा 3 डी) में जीवित रहने के विफल करना चाहिए. एक alginate hydrogel मैट्रिक्स के भीतर परिपक्वता व्यक्ति रोम की संस्कृति कहीं 10 में वर्णित किया गया है .

प्रोटीन या शाही सेना में बदलाव पूरे अंग से या enzymatic गिरावट (चित्रा 4) का उपयोग कर विशिष्ट कक्ष प्रकार से विश्लेषण किया जा सकता है. Collagenase के साथ सुसंस्कृत डिम्बग्रंथि organoids के उपचार अंतर्निहित (चित्रा 4C) बरकरार stroma जबकि OSE के सेल गोली इलाज के बाद प्राप्त में संवर्धन के लिए अनुमति पत्ते, हालांकि कुछ stromal कोशिकाओं को भी अलग कर रहे हैं (चित्रा 4D).

चित्रा 1
चित्रा माउस 1. अंडाशय तीन आयामी संस्कृति लोग घायल हो गए के बाद OSE प्रचार के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली. ए) खुर्दबीन के तहत, बर्सा और आसपास के वसा पैड हटा दिया गया. बी) oviductal ट्यूब के साथ बरकरार (का.) अंडाशय (टी) और वसा पैड (एफ). सी) बर्सा और वसा पैड के साथ अंडाशय (बाएं) हटा दिया है और uncoiled oviduct (दाएं). डी) डिम्बग्रंथि या oviductal organoids एक alginate छोटी बूंद में रखा गया. ई) Alginate encased organoids CaCl 2 समाधान crosslinking alginate एक जेल फार्म में गिरा दिया गया. एफ) Alginate डिम्बग्रंथि organoid समझाया. जी) Alginate oviductal organoid समझाया. एच) Alginate समझाया organoids संस्कृति माध्यम में incubated.

चित्रा 2
चित्रा 2. डिम्बग्रंथि 8 cytokeratin द्वारा मापा सतह से सतह क्षेत्र पुनर्जीवित. डिम्बग्रंथि organoids के eighths, क्वार्टर, और आधा, BSA माध्यम सुसंस्कृत और immunohistochemical cytokeratin 8 (CK8) एंटीबॉडी का उपयोग विश्लेषण द्वारा मापा में कटौती होने के बाद OSE से इनकैप्सुलेशन.

चित्रा 3
चित्रा Alginate 3. संस्कृति प्रणाली वृद्धि कारकों के पारित होने और OSE में सीडीएनए के अभिकर्मक की अनुमति देता है, लेकिन तेजी से और रोम के विकास और परिपक्वता का समर्थन नहीं करता. ए) डिम्बग्रंथि organoid बेसल CK8 अभिव्यक्ति है, जो OSE निशान के लिए विश्लेषण मध्यम में 7 दिनों के लिए सुसंस्कृत. इनसेट, धारावाहिक अनुभाग BrdU समावेश के लिए दाग. बी) इंसुलिन की संस्कृति मीडिया के अलावा OSE के hyperplasia लाती है. इनसेट, धारावाहिक अनुभाग BrdU समावेश के लिए दाग. सी) डिम्बग्रंथि organoid GFP व्यक्त सीडीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट. डी) Alginate संस्कृति प्रणाली मौलिक रोम (लाल arrowhead) के विकास का समर्थन करता है, लेकिन परिपक्व नहीं माध्यमिक रोम (काला तीर).

चित्रा 4
चित्रा 4. OSE विश्लेषण निम्नलिखित संस्कृति के लिए अलग किया जा सकता है है . ए) Organoid 2 सप्ताह के लिए माध्यम में सभ्य. बी) समझाया organoid alginate lyase organoid बरकरार छोड़ के साथ इलाज किया है. अंडाशय CK8 के साथ निशान OSE दाग है. सी) Organoid अंतर्निहित stroma से अलग OSE collagenase के साथ इलाज किया जाता है. शेष ऊतक टुकड़ा CK8 साथ दाग था डिम्बग्रंथि सतह के हटाने पर प्रकाश डाला. डी) इलाज के बाद एकत्र कोशिकाओं OSE के लिए CK8 (लाल) के दाग के रूप में समृद्ध है. कक्ष DAPI के साथ counterstained रहे हैं नाभिक निशान.

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Discussion

एक तीन आयामी अंग संस्कृति alginate hydrogels का उपयोग प्रणाली के विकास के जीवों की एक विस्तृत विविधता से में कई अलग अलग प्रकार के ऊतक का विश्लेषण करने के लिए एक बहुमुखी विधि का प्रतिनिधित्व करता है. 3D संस्कृतियों के उपयोग के ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र को बढ़ाया जा सकता है के रूप में यह एक पाड़ जिस पर कोशिकाओं 11 विकसित कर सकते हैं प्रदान करता है. वर्तमान में, हमारी प्रयोगशाला प्रारंभिक मानव डिम्बग्रंथि और फैलोपियन ट्यूब के ऊतकों का उपयोग पढ़ाई के दौर से गुजर रहा है, तथापि, मानव और गैर मानव प्राइमेट रोम की संस्कृति 12,13 वर्णित किया गया है.

alginate hydrogels के संस्कृति organoids उपयोग करने के लिए hydrogels के अन्य प्रकार से अधिक उन शामिल कोलेजन, आतंच, या hyaluronic एसिड के रूप में कई फायदे, प्रदान करता है. कमरे के तापमान और तटस्थ पीएच Alginate जैल, ऊतकों को थोड़ा व्यवधान के लिए प्रदान के रूप में जेल organoid 14 encapsulates. Alginate सेलुलर प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है, ऊतक वृद्धि 5 के लिए एक रासायनिक आभ्यांतरिक समर्थन प्रदान . जेल enzymatically अपमानित का उपयोग alginate lyase, जो समझाया ऊतक नीचा नहीं हो, सुसंस्कृत 15 कोशिकाओं की पुनर्प्राप्ति के लिए अनुमति दे सकते हैं . Alginate hydrogels के तीन आयामी ऊतक संस्कृति के लिए उपयोग का एक नुकसान यह है कि ईओण hydrogel के लिए यांत्रिक सहायता प्रदान crosslinking समय पर स्थिरता खो देता है, सीमित संस्कृति alginate के समय और फिर से crosslinking 5 निर्धारण से पहले की जरूरत महसूस . इस प्रोटोकॉल के क्रांतिक पहलुओं संस्कृति प्रक्रिया भर में बाँझपन बनाए रखने रहे हैं, के रूप में डिम्बग्रंथि और oviductal ऊतक ऊतक आकारिकी अवरोधों को रोकने के सावधान विच्छेदन के रूप में अच्छी तरह से.

अंडाशय और oviduct विशेष रूप से इस विधि के लिए उपयुक्त हैं क्योंकि डिम्बग्रंथि सतह उपकला पारंपरिक सेल संस्कृति प्लास्टिक पर सुसंस्कृत mesenchymal संक्रमण, morphological परिवर्तन, और कोशिका मृत्यु के लिए तेजी से उपकला SV40 प्रतिजन टी / टी या 16 hTERT की अभिव्यक्ति द्वारा अमर जब तक, उदाहरण के लिए आए, 17. प्लास्टिक पर सामान्य OSE के गरीब वृद्धि संभावित पूर्व घातक परिवर्तन के विश्लेषण hinders. अंग संस्कृति प्रणाली भी डिम्बग्रंथि सतह या अंतर्निहित stromal कोशिकाओं, जो cells18 की सामान्य और घातक फिजियोलॉजी में एक भूमिका निभा सकते हैं के साथ संपर्क में oviductal उपकला उपकला के विकास का समर्थन करता है. Alginate hydrogels में इन प्रकार के ऊतकों की संस्कृति यांत्रिक सहायता प्रदान करता है ऊतक के तीन आयामी संरचना को बनाए रखने, जबकि जेल में ही 5 कोशिकाओं के साथ बातचीत नहीं करता है.

संवर्धन डिम्बग्रंथि सतह उपकला या oviductal उपकला के लिए इस पद्धति का उपयोग करके आणविक और morphological परिवर्तन संस्कृति के अलग जोड़तोड़ से उत्पन्न के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है. alginate hydrogel प्रणाली मुक्त बीतने के ट्रांसफ़ेक्ट सीडीएनए siRNA, और shRNA, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से, हार्मोन और वृद्धि कारकों 19 परमिट. जबकि क्षणिक अभिकर्मक OSE के लिए विशिष्ट नहीं है, क्योंकि इस कोशिका प्रकार organoid उच्च अभिकर्मक दक्षता की बाहरी सतह पर अंडाशय के इंटीरियर में अन्य कक्ष granulosa कोशिकाओं के रूप में, प्रकार की तुलना में है OSE में हासिल की है. Bromodeoxyuridine की संस्कृति अवधि सेलुलर विकास में निगरानी में परिवर्तन के द्वारा प्रयोगात्मक शर्तों के जवाब में कोशिकाओं को विभाजित लेबल के दौरान निगमन. शाही सेना या प्रोटीन के स्तर में परिवर्तन आण्विक तो neoplastic परिवर्तन करने के लिए प्रमुख तंत्र को स्पष्ट करने के लिए निर्धारित किया जा सकता है.

जबकि डिम्बग्रंथि के कैंसर का सटीक एटियलजि अज्ञात है, जीवनकाल ovulations की बढ़ती संख्या के लिए डिम्बग्रंथि के कैंसर के 20 के लिए एक खतरा बढ़ के साथ सहसंबंधी करने के लिए दिखाया गया है. डिम्बग्रंथि के कैंसर के लिए ovulation जोड़ने परिकल्पना के vivo विश्लेषण में गोनैडोट्रॉपिंस, प्रसार, और 21-23 carcinogenesis सूजन के योगदान का निर्धारण करने में कई चुनौतियां प्रस्तुत करता है. अंडाशय और oviducts Alginate hydrogel संस्कृति पृथक, डिम्बग्रंथि सतह उपकला और oviductal उपकला में इन घटकों में से प्रत्येक के एक प्रत्यक्ष तुलना के लिए अनुमति देता है, डिम्बग्रंथि के कैंसर के मूल और सामान्य कोशिकाओं से ट्यूमर के लिए प्रगति के बारे में नई जानकारी के लिए अग्रणी.

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Disclosures

खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम डिम्बग्रंथि के कैंसर अनुसंधान द्वारा समर्थित किया गया फंड [अनुदान LT/UIC/01.2011], नैदानिक ​​और translational विज्ञान, यूआईसी स्वास्थ्य अनुदान C06RR15482 के कैंसर केंद्र, और राष्ट्रीय संस्थानों के लिए यूआईसी केंद्र.

जानवरों पर प्रयोगों AAALAC द्वारा प्रस्तुत पशु देखभाल और यूआईसी पर उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित जानवरों की देखभाल प्रोटोकॉल के तहत निर्धारित दिशा निर्देशों और नियमों के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. शिकागो में इलिनोइस विश्वविद्यालय में इस परियोजना के लिए पशु बाधा कमरे में जैविक संसाधन प्रयोगशाला (BRL) में रखे जाते हैं. BRL एक पूरी तरह से पशु चिकित्सा स्टाफ है कि जानवरों को कम से कम दो बार दैनिक पर नज़र रखता है और जानवरों की देखभाल पर सलाह प्रदान करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz L-15 medium GIBCO, by Life Technologies 11415
αMEM medium GIBCO, by Life Technologies 12000-022
Sodium alginate NovaMatrix
Sodium cacodylate Sigma-Aldrich C0250
Polypropylene mesh fiber McMaster-Carr 45" wide roll; 0.0041" opening
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668
Penicillin/streptomycin GIBCO, by Life Technologies 15070-063
Alginate lyase Sigma-Aldrich A1603
A1603 Sigma-Aldrich C9697 From Clostridium histolyticum
Bovine serum albumin MP Biomedicals 103700
Fetal bovine serum GIBCO, by Life Technologies Gibco
ITS solution Roche Group 11074547001 Insulin/transferrin/sodium selenite
Cytokeratin 8 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank TROMA-1 Use at 1:200
DAPI Vector Laboratories H1200
Bromodeoxyuridine Sigma-Aldrich B50002-1G Final concentration 10 μM

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References

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बायोइन्जिनियरिंग 52 अंक alginate hydrogel डिम्बग्रंथि अंग संस्कृति oviductal अंग संस्कृति तीन आयामी प्राथमिक कोशिका
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King, S. M., Quartuccio, S., Hilliard, T. S., Inoue, K., Burdette, J. E. Alginate Hydrogels for Three-Dimensional Organ Culture of Ovaries and Oviducts. J. Vis. Exp. (52), e2804, doi:10.3791/2804 (2011).

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