Summary
그들의 입체적인 맥락에서 정상 세포의 문화 세포 변형 및 tumorigenesis에 필요한 초기 이벤트를 연구하는 다른 방법을 나타냅니다. 이 방법은 난소암 형성 초기에 이벤트를 연구 정상 난소와 oviductal 세포를 성장하는 데 사용됩니다.
Abstract
난소암은 여성 암 사망의 다섯 번째 주요 원인이며, 미국 1 63% 사망률이 있습니다. 난소 암에 대한 원산지 세포 유형은 문제가 여전히하거나, 난소 표면 상피 (오세) 또는 나팔관의 fimbriae 2,3의 말초 상피 수 있습니다. 체외의 기본 문화로 정상 세포 Culturing 과학자함으로써 definitively 원산지의 세포 유형을 결정, 뚜렷한 상피에서 난소암으로 이어질 수도 있습니다 특정 변경 내용을 모델로 사용됩니다. 이것은이 질병을 대상으로보다 정확한 생체, 조직 특정 유전자의 변화와 동물 모델, 그리고 더 나은 예방 전략의 개발을하실 수 있습니다.
알지네이트요의 hydrogels에서 정상 세포를 유지하는 것은 자신의 입체적인 맥락에서 세포의 체외 배양에 단기을 촉진하고 플라스미드 DNA, siRNA, 작은 분자의 도입을 수 있습니다. 하나의 동물에서 실험의 수를 증가 하나 장기 생성하실 수 있습니다 메스, 여러 문화를 사용하는 전략 상처에서 파생됩니다 조각 culturing 기관에 의해. 이것은 난소암의 형성과 관련된 오세의 확산에 선도적인 배란의 모델 측면을 인하. 이러한 플라스틱 표면에 잘 성장하지 않는 오세으로 셀 형식은이 방법을 사용하여 교양과 정상 세포의 프로세스 또는 암 형성 4에서 가장 오래된 행사로 조사를 용이하게하실 수 있습니다.
알긴산의 hydrogels는 조직 5 다양한 종류의 성장을 지원하기 위해 사용할 수 있습니다. 알긴산은 손상 조직 6,7하지 않는 부드러운 겔화 작업의 결과, β - D - mannuronic의 산성과 칼슘 이온과 가교 수있는 α - L - guluronic 수 소산의 단위를 반복 구성된 선형 다당류이다. 같은 Matrigel 같은 다른 세 차원 세포 배양 매트릭스와 마찬가지로 알지네이트요 티슈에 대한 기계적 지원을 제공하지만, 단백질은 알지네이트요 매트릭스와 반응하지 않습니다, 따라서 세포가 5 신호 시작하지 않는 합성 세포외 기질로 알지네이트요 기능. 알지네이트요의 히드로겔 표준 세포 배양 매체 수레와 체외에서 조직 성장의 아키텍처를 지원합니다.
방법을 준비, 분리, 최대 2 주가에 대한 문화의 유지 수 알지네이트요의 hydrogels로 난소 및 oviductal 오르간 작품의 포함을 위해 제공됩니다. 장기 문화 단백질과 RNA 샘플의 분석을 위해 세포의 효소 출시도 설명합니다. 마지막으로, 기본 세포 유형의 성장은 생쥐에서 유전자 불멸화없이 가능하며 한방과 유전자 변형 마우스를 사용하는 수사관을 수 있습니다.
Protocol
1. 난소 해부와 조직 분리
- 나트륨 알지네이트요의 0.5 % (W / V) 솔루션을 준비, 프로토콜의 수정된 버전에서 준비 살균 PBS 37에 열을 ° C.를 사용하여 이전 5 설명 역전이나 락을로 믹스지만, 와동하지 않습니다. 25 G 바늘로 1 ML의 주사기에 알지네이트요를 그려 37에서 유지 ° C.
- crosslinking 조직 캡슐에 알지네이트요 37에 따뜻한 ° C.에 대한 10mM CaCl 2 무균 용액 준비
- 문화 매체 (αMEM + 5 단위의 페니실린 및 5 μg / ML 스트렙토 마이신) 당 잘 각 실험 24 잘 접시의 1mL를 준비합니다. 문화 매체의 다양한 약물, 펩티드, 또는 바이러스를 포함합니다. 이전 기관의 캡슐에 transfection을 위해, 37 ° C.에서 4 시간 동안 Lipofectamine 2000 및 플라스미드 DNA와 조직을 품어
- 동물의 장기를 절개하다, 어떤 지방이나 잔여 조직을 제거 부드럽게 난소를 둘러싼 부르사 막 해내, 그리고 오르간을 bisecting × 4 조각으로 난소 또는 수란관 잘라. 동물은 자궁 경부 전위 다음 CO 2 질식에 의해 euthanized되었다. 수란관 들어, 부드럽게 연결 세포막을 분리 당기 및 절단하기 전에 집게를 사용하여 반대 방향으로 튜브의 끝부분을 확장하여 조직을 풀다.
- 멸균 메쉬 섬유에 하나 알지네이트요의 비말을 (~ 1-3 μL) 장소.
- 무균 집게를 사용하여 알지네이트요 비말 및 센터 포셉 또는 멸균 바늘을 사용하여 작은 물방울을 장기로의 조각을 이동합니다.
- 무균 포셉와 메쉬 섬유 쥐고과 중력이 매달려 드롭에 알지네이트요을 강제 수 있도록 거꾸로 그것을 전환하여 장기 조각 (organoid)이있는 비말을 반전.
- 드롭 솔루션으로 떨어지는 있도록 10mM CaCl 2 용액이 들어있는 10cm 페트리 접시의 가장자리에있는 집게를 누릅니다.
- 2 분 동안 품어, 문화 매체에 추가 10mM CaCl 2 및 전송을 공개하기 위해 모공을 포함하는 멸균 스푼으로 제거합니다. 최대 네 개까지 알지네이트요의 젤로가 문화 매체를 포함하는 24 잘 접시의 단일 잘으로 전송할 수 있습니다. 정의된 기간 동안 문화.
2. 세포의 알긴산과 수집 저하
- 알지네이트요 젤의 solubilization 들어, ° C 30 분 또는 때까지 젤이 완전히 해소됩니다 37 Leibovitz의 L - 15 미디어에 녹아있는 알지네이트요의 lyase (3.4 MG / ML)의 문화를 품다.
- 알지네이트요의 lyase에서 조직을 제거합니다.
- 오세 수집 1 시간 8 Leibovitz의 L - 15 미디어에서 collagenase 500 단위로 organoid을 품어. 1 분 일초 펄스 (1 초 와동과 일초 나머지) 다음 1 분 중간 전원 이초 펄스 (이초 와동과 이초 휴식)에 소용돌이. 장기 조각이 신선한 불임 microcentrifuge 관에 microcentrifuge 관 및 피펫 뜨는의 하단에 가을 보자. 펠렛의 난소 표면 상피에 3,000 rpm으로 3 분 원심 분리기.
- 투발 상피를 수집, 5 단위 페니실린 및 5 μg / ML의 스트렙토 마이신과 4 % (V / V) FBS과 DMEM의 조직 문화 플라스틱에 길이 튜브를 잘라 놓으십시오. 3~5일 동안 세포는 같은 민족인 기질에서 "크롤링"것이며, 조직 문화 plastic9에서 성장.
3. 파라핀 섹션에 대한 알지네이트요 캡슐 장기 문화의 고정
- 선택한 시점에서 배지에서 비드 캡슐 알지네이트요를 수집합니다.
- 2 분 동안 멸균 10mM CaCl 2 용액으로 문화를 놓아 젤 등귀하다하는 알지네이트요을 Recrosslink.
- 젤 고체 유지하고 완벽하게 고정하는 동안 조직을 캡슐 수 있도록 50 MM의 자당, 10 MM CaCl 2 50 MM 나트륨 cacodylate를 포함하는 2 % paraformaldehyde에 알지네이트요 캡슐 오르간을 수정.
- 조직 처리에 따라, 파라핀, 5 μm의 섹션을 생성 마이크로톰과 함께 부분에 전체 알지네이트요 - 캡슐 장기 문화 부분을 포함.
- 알지네이트요는 해산을 기반으로 항원 검색을 열로 인해 immunohistochemistry를 수행하면 슬라이드에서 제거됩니다. 알지네이트요는 남아 hematoxylin 및 eosin의 얼룩 서 아래 eosin에 대한 얼룩 것입니다.
4. 대표 결과 :
난소와 수란관의 3 차원 장기 문화의 예제는 그림 1에 표시됩니다. 난소는 다른 크기의 조각으로 잘라, 그리고 오세은 세포 분열 따위에 의해 번식하고 메스로 절개의 상처를 입었다고 표면을 복구하기 위해 마이 그 레이션 할 수 있습니다. 이 과정에서, 기본 기질에 상대적으로 오세의 올바른 방향은 난소를 캡슐 오세와 함께 유지됩니다. 그림 2에 표시된 구역 또는 eighths을 침범한 난소에 비해, 반으로 난소의 오세 더 완전히 난소를 캡슐. 난소의 상처 수리표면은 전체 난소의 맥락에서 연구 수 있으며, 배란과 표면 수리가 난소 표면 변형을 유도하는 방법에 대해 설명해 주실 수 있습니다.
실험의 종점은 필요한 정보에 따라 달라집니다. 조직 구조, 세포 형태학 및 특정 세포 성장 속도를 쉽게 파라핀 섹션을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 7 일 동안 5 μg / ML 인슐린 이외의 난소 표면 상피와 여러 계층의 형성의 hyperproliferation을 유도하면서 예를 들어, 난소 표면 상피의 단일 계층은 7 일 (그림 3A)에 대한 혈청 무료 αMEM에 culturing 후 관찰 세포 (그림 3B). 이전 고정 10 μm의 24 시간의 최종 농도에서 문화 bromodeoxyuridine를 추가하여, 세포의 증식이 (삽입된 페이지 3A 및 3B) 측정할 수 있습니다. granulosa 세포의 큰 비율 분아 따위에 의해 번식하는 동안 혈청 무료 αMEM 유지 문화, 오세 약 3~5%은 24 시간 라벨 기간 (삽입된 페이지 3A) 동안 증식을 받고있다. 문화 미디어 인슐린 또한 총 오세의 약 30 % (삽입된 페이지 3B)으로 오세를 proliferating의 비율을 증가시킵니다. 녹색 형광 단백질 (GFP)의 Immunofluorescence은 cDNA transfection (그림 3C) 다음과 같은 표준 현미경으로 알지네이트요 젤을 통해 시각 수 있습니다. 알지네이트요 오르간 문화가 난소 표면 상피 및 기본 머리카락 성장과 분석을 위해 제공하고 있지만, 그것은 성숙, 보조 모공이 문화 시스템 (그림 3D)에 생존하지 않을 것을인지해야합니다. 알지네이트요의 히드로겔 매트릭스 내에서 성숙 개별 모공의 문화가 다른 열 설명되었습니다.
단백질이나 RNA의 변경은 전체 기관 또는 효소 분해 (그림 4)를 사용하여 특정 세포 유형에서 분석할 수 있습니다. 일부 stromal 세포도 (그림 4D) 절연 있지만 collagenase와 교양 난소 organoids의 치료, 펠렛은 다음과 같은 치료를 얻은 세포의 오세의 농축을 허용하는 동시에 (그림 4C) 그대로 기본 기질을 떠납니다.
입힐 수있는 총알 후 오세을 전파하기 위해 사용 그림 1. 마우스 난소 입체 문화 시스템. A) 현미경, 부르사 및 주변 지방 패드가 삭제되었습니다. B) 손상 oviductal 튜브와 난소 (O) (T) 및 지방 패드 (F). C) 부르사 지방 패드와 난소가 제거 (왼쪽)와 uncoiled 수란관 (오른쪽). D) 난소 또는 oviductal organoids는 알지네이트요 비말에 배치했다. E) 알긴산 쌌다 organoids은 CaCl 2 용액 crosslinking 젤 형태 알지네이트요로 감소했다. F) 알긴산은 난소 organoid를 캡슐. G) 알긴산은 oviductal의 organoid를 캡슐. H) 알긴산 캡슐 organoids 문화 매체에 incubated.
그림 2. 표면적 cytokeratin 8 시까지 측정 난소 표면에 의해 생성. eighths, 분기, 그리고 반쪽, BSA 매체에서 교양 및 cytokeratin 8 일 (CK8) 항체를 사용 immunohistochemical 분석하여 측정을 침범한 후에 오세에 의해 난소 organoids의 캡슐.
그림 3. 알긴산 문화 시스템은 성장 요인의 통과와 오세로 cDNA의 transfection을 허용하지만, 모공의 급속한 성장과 성숙을 지원하지 않습니다. A) 난소 organoid은 오세을 표시 CK8 표현에 대한 분석 기초 매체 7 일 교양. 삽입된 페이지, 시리얼 섹션 BrdU의 설립을 위해 얼룩. B) 문화 미디어에 인슐린의 추가는 오세의 증식을 유도. 삽입된 페이지, 시리얼 섹션 BrdU의 설립을 위해 얼룩. C) 난소 organoid는 GFP를 표현하기 위해 cDNA와 transfected. D) 알긴산 문화 시스템은 원시 모공 (빨간색 화살촉)의 성장을 지원하지만 성숙하지 보조 머리카락 (검은색 화살표).
그림 4. 오세은 분석을 다음과 문화 격리 수 있습니다. A) Organoid가 이주하는 매체 교양. B) 캡슐의 organoid는 organoid 그대로두고 알지네이트요의 lyase와 함께 처리됩니다. 난소는 마르크 오세에 CK8 물들일 것입니다. C) Organoid는 근본적인 기질과는 별도로 오세하는 collagenase로 처리됩니다. 남은 조직의 일부가 난소 표면의 제거를 강조 CK8 물들일했다. CK8 (적색)에 대한 스테인드로 D) 치료를 다음과 수집된 세포 오세에 대한 풍부합니다. 세포는 핵을 표시 DAPI로 counterstained 있습니다.
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Discussion
알지네이트요의 hydrogels를 이용한 3 차원 오르간 문화 시스템의 개발은 생물의 다양한에서 여러 가지 조직 유형을 분석하는 다양한 방법을 나타냅니다. 그것이 세포가 11 성장할 수있는 발판을 제공과 같은 3D 문화의 사용은 조직 공학 및 재생 의학 분야로 확장될 수 있습니다. 현재, 저희 연구실은 인간의 난소와 나팔관 조직을 사용하여 초기 연구를 겪고 있지만, 인간이 아닌 인간 영장류 머리카락 문화 12,13 설명했습니다.
문화 organoids에 알지네이트요의 hydrogels의 사용은 이러한 통합 콜라겐, 섬유소, 또는 hyaluronic 산성 등 hydrogels 다른 유형의 여러 장점을 제공합니다. 젤 organoid 14 캡슐로 실내 온도와 중성 산도에서 알긴산의 젤은 조직에 약간의 장애가 제공합니다. 알긴산은 조직의 성장 5 화학적으로 불활성 지원을 제공, 휴대 단백질과 반응하지 않습니다. 젤은 교양 세포 15 검색에 대한 있도록 캡슐 조직을 저하하지 않는 효소 저하를 사용 알지네이트요의 lyase, 수있다. 입체 조직 문화의 알지네이트요의 hydrogels의 사용 중 하나 단점은 히드로겔에 대한 기계적 지원을 제공하는 이온 crosslinking 전에 고정 5 제한된 문화 기간과 알지네이트요의 다시 crosslinking을 necessitating, 시간이 지남에 따라 안정성을 잃는 것입니다. 이 프로토콜의 가장 중요한 측면뿐만 아니라 난소 및 조직 형태에 중단을 방지하기 위해 oviductal 조직의주의 절개로 문화 과정에서 불임을 유지하고 있습니다.
전통적인 세포 배양 플라스틱에 대한 교양 난소 표면 상피 빠르게 SV40 T / T 항원 또는 hTERT 16 표현으로 영원히하지 않는, 예를 들어 mesenchymal 전환, 형태학의 변화 및 세포 사망 상피 겪습 때문에 난소와 수란관은 특히,이 방법에 적합 17. 플라스틱에 대한 일반 오세의 가난한 성장 가능성이 사전 악성 변화의 분석을 방해. 오르간 문화 또한이 시스템은 cells18의 정상 및 악성 생리학의 역할을 수있는 기본 stromal 세포와 접촉 난소 표면 상피 또는 oviductal 상피의 성장을 지원합니다. 알지네이트요의 hydrogels에서 이러한 조직 유형의 문화 젤 자체가 세포 5 상호 작용하지 않는 반면, 조직의 입체 구조를 유지하기 위해 기계 지원을 제공합니다.
culturing의 난소 표면 상피 또는 oviductal 상피이 방법을 사용하면 문화의 절연 조작으로 인한 분자 및 형태학의 변화 분석을 위해 수 있습니다. 알지네이트요의 히드로겔 시스템은 무료로 transfected cDNA, siRNA의 통과와 shRNA뿐만 아니라 호르몬, 성장 요인 19 수 있습니다. 과도 transfection이 셀 타입 이러한 granulosa 세포로 난소의 내부에있는 다른 세포 유형에 비해 organoid 높은 transfection 효율의 외부 표면에있는 오세에 달성되기 때문에, 오세 특정하지 않습니다. 없지만 실험 조건에 대한 응답으로 세포 성장의 모니터링 변화로 세포를 나누어 문화 기간 동안 bromodeoxyuridine 레이블의 설립. RNA 또는 단백질 수준에서 분자 변경 사항은 다음 종양 변화로 이어지는 메커니즘을 명료하게하다하기로 결정하실 수 있습니다.
난소암의 정확한 병인은 불명이지만, 평생 ovulations의 증가 숫자는 난소암 20 위험이 증가와 연관시키는 것은 표시되었습니다. 난소암에 배란을 연결하는 가설의 생체내 분석 gonadotropins, 증식, 그리고 carcinogenesis 21-23로 염증의 기여를 결정하는 많은 도전을 선물한다. 난소와 oviducts의 알긴산의 히드로겔 문화 난소암의 기원과 정상 세포에서 종양하기 위해 진행에 관한 새로운 정보로 이어지는, 난소 표면 상피와 oviductal 상피에서 이러한 구성 요소를 각각의 절연, 직접 비교를 허용합니다.
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Disclosures
공개 아무것도 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 난소암 연구 기금에 의해 지원되었다 [부여 LT/UIC/01.2011] 임상 및 Translational 과학, UIC 암 센터, 보건 부여 C06RR15482 국립 연구소에 대한 UIC 센터.
동물 실험은 UIC의 동물 케어 및 사용위원회의 승인을 동물 관리 프로토콜에 따라 AAALAC에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다. 이 프로젝트에 대해 동물 시카고 일리노이 대학에서 생물 자원 연구소 (BRL)에 장벽 장소에 있습니다. BRL 적어도 두 번 매일 동물을 모니터링하고 동물 보호에 대한 조언을 제공하는 완전히 수의과 직원이 있습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
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