Summary
Cultivo de células normales en sus tres dimensiones contexto representa un método alternativo para estudiar los primeros eventos necesarios para la transformación celular y tumorigénesis. Este método se utiliza para producir los ovarios normales y las células del oviducto para estudiar los eventos tempranos en la formación de cáncer de ovario.
Abstract
El cáncer de ovario es la quinta causa principal de muerte por cáncer en las mujeres y tiene una tasa de mortalidad del 63% en los Estados Unidos 1. El tipo de célula de origen de los cánceres de ovario sigue siendo en cuestión y podría ser el epitelio superficial del ovario (OSE) y del epitelio distal de la trompa de Falopio fimbrias 2,3. El cultivo de las células normales como cultivo primario in vitro permitirá a los científicos para modelar los cambios específicos que podrían conducir al cáncer de ovario en el epitelio distintas, lo que definitivamente la determinación del tipo de célula de origen. Esto permitirá el desarrollo de marcadores biológicos más precisos, los modelos animales con cambios en los tejidos específicos de genes, y mejores estrategias de prevención dirigidas a esta enfermedad.
El mantenimiento de las células normales en los hidrogeles de alginato promueve a corto plazo en el cultivo in vitro de las células en sus tres dimensiones contexto y permite la introducción de ADN plásmido, siRNA, y moléculas pequeñas. Por los órganos de cultivo en las piezas que se derivan de los cortes estratégicos utilizando un bisturí culturas, varios de un solo órgano se pueden generar, aumentar el número de experimentos de un solo animal. Estos recortes aspectos el modelo de la ovulación que conduce a la proliferación de la OSE, que se asocia con la formación de cáncer de ovario. Tipos de células, como el entorno de sistema operativo que no crecen bien en superficies de plástico pueden ser cultivadas con este método y facilitar la investigación sobre los procesos celulares normales o los primeros eventos en la formación del cáncer 4.
Hidrogeles de alginato se pueden utilizar para apoyar el crecimiento de muchos tipos de tejidos 5. El alginato es un polisacárido lineal compuesto por unidades repetidas de β-D-manurónico ácido y α-L-gulurónico ácido que puede ser reticulado con iones de calcio, lo que resulta en una acción gelificante suave que no dañan los tejidos 6,7. Al igual que otras matrices tridimensionales de cultivo celular como Matrigel, alginato proporciona soporte mecánico para los tejidos, sin embargo, las proteínas no son reactivos con la matriz de alginato, y por eso funciona como una matriz de alginato de síntesis extracelular que no inicia la señalización celular 5. El hidrogel de alginato flota en el medio de cultivo celular estándar y compatible con la arquitectura del crecimiento de los tejidos in vitro.
Se presenta un método para la preparación, la separación, y la inclusión de ovario y el oviducto pedazos de órganos en los hidrogeles de alginato, que pueden mantenerse en cultivo durante un máximo de dos semanas. La liberación enzimática de las células para el análisis de proteínas y RNA de muestras de la cultura de órganos también se describe. Finalmente, el crecimiento de tipos de células primarias es posible sin la inmortalización genética de ratones y permite a los investigadores a utilizar por nocaut y en ratones transgénicos.
Protocol
1. La disección de ovario y el aislamiento de los tejidos
- Prepare una solución al 0,5% (w / v) de alginato de sodio, de preparar una versión modificada del protocolo descrito previamente 5, con PBS estéril y calentar a 37 º C. Mezclar por inversión o de rock, pero no del vórtice. Dibujar el alginato en una jeringuilla de 1 ml con una aguja de 25 G y mantener a 37 ° C.
- Prepare 10 mM estéril solución de CaCl2 para la reticulación del alginato en la encapsulación de tejido y calentar a 37 º C.
- Prepare 1 ml de medio de cultivo (αMEM + 5 unidades de penicilina y estreptomicina 5 mg / ml) por pocillo en una placa de 24 pocillos para cada experimento. Incluyen diversos fármacos, péptidos, o virus en el medio de cultivo. Para la transfección antes de la encapsulación de órganos, los tejidos se incuba con Lipofectamine 2000 y el ADN del plásmido durante cuatro horas a 37 º C.
- Diseccionar los órganos del animal, eliminar o quitar cualquier grasa o tejido residual, tire suavemente de la membrana que rodea la bursa del ovario, y cortar los ovarios o el oviducto en cuatro pedazos por que atraviesa el órgano. Los animales fueron sacrificados por asfixia de CO 2 seguido por dislocación cervical. Para el oviducto, desenrollar suavemente el tejido tirando de las membranas de conexión y ampliación de los extremos del tubo en sentido contrario el uso de fórceps antes de cortar.
- Coloque una gota de alginato solo (l ~ 1-3) en una malla de fibra de esterilización.
- Con unas pinzas estériles, mover una pieza de órgano en la gota de alginato y el centro de la gota uso de fórceps o una aguja estéril.
- Invertir la gota que contiene la pieza de órgano (organoide), tome el malla de fibra con pinzas estériles y se vuelve boca abajo para que la gravedad de la fuerza del alginato en una gota.
- Toque la pinza en el borde de un plato de Petri que contiene 10 mM de 10 cm de CaCl2 solución para que la gota cae en la solución.
- Incubar durante 2 minutos, retire con una cuchara estéril que contiene poros para el lanzamiento adicional de CaCl 2 10 mM, y la transferencia al medio de cultivo. Hasta cuatro geles de alginato se pueden transferir a un solo pozo de una placa de 24 pocillos que contienen el medio de cultivo. Cultura por un periodo de tiempo definido.
2. La degradación de alginato y la recolección de las células
- Para la solubilización del gel de alginato, se incuban los cultivos en alginato liasa (3,4 mg / ml) disuelto en L-15 de Leibovitz medios de comunicación a 37 ° C durante 30 minutos o hasta que el gel esté completamente disuelta.
- Eliminar el tejido de la liasa de alginato.
- Para la recogida de la OSE, se incuban los organoides con 500 unidades de la colagenasa en el L-15 de Leibovitz medios de comunicación durante 1 hora 8. Vortex en dos pulsos segundo (2 segundos y 2 segundos vórtice resto) a una potencia media durante 1 minuto, seguido por un segundo pulso (1 segundo vórtice y un segundos de descanso) durante 1 minuto. Deje que las piezas caen al fondo del órgano de tubo de microcentrífuga y el sobrenadante de la pipeta en un tubo nuevo de microcentrífuga estéril. Centrifugar 3 minutos a 3000 rpm en el epitelio superficial del ovario de pellets.
- Para la recogida del epitelio de las trompas, cortar el tubo a lo largo y lugar en el plástico de cultivo de tejidos en DMEM con 5 unidades de penicilina y 5 mg / ml de estreptomicina y 4% (v / v) de SFB. Durante 3-5 días, las células se "arrastre" de la estroma de trompas y crecer en cultivo de tejidos plastic9.
3. La fijación de las culturas de alginato de órganos encapsulados para cortes de parafina
- Recoger el alginato encapsulado de cuentas del medio de cultivo en el punto de tiempo seleccionado.
- Recrosslink el alginato para endurecer el gel por la caída de la cultura en el estéril de CaCl2 10 mM solución de dos minutos.
- Fijar el órgano encapsulado en alginato paraformaldehído al 2% que contiene 50 mM de sacarosa, CaCl2 10 mM y 50 mM cacodilato de sodio para asegurar que el gel se mantiene sólido y totalmente encapsula los tejidos durante la fijación.
- Después de procesamiento de tejidos, integrar todo el alginato encapsulado pieza cultivo de órganos en parafina y sección con un microtomo para generar secciones de 5 micras.
- El alginato se disolverá y se retira de la diapositiva si se realiza inmunohistoquímica debido al calor de recuperación de antígeno base. El alginato se mantendrá y manchas de eosina en pie hematoxilina y eosina.
4. Los resultados representativos:
Un ejemplo de una cultura del órgano en tres dimensiones del ovario y el oviducto se muestra en la Figura 1. Los ovarios se pueden cortar en trozos de diferente tamaño, y OSE proliferar y migrar a la reparación de la superficie que resultó herido de la incisión con el bisturí. Durante este proceso, la orientación correcta de la OSE en relación con el estroma subyacente se mantiene, con la OSE encapsular el ovario. Como se muestra en la Figura 2, la OSE de los ovarios reduce a la mitad encapsular el ovario de forma más completa, en comparación con los ovarios cortadas en cuartos u octavos. La reparación de las heridas de los ovariosla superficie puede ser estudiado en el contexto de todo el ovario y puede arrojar luz sobre cómo reparar la ovulación y la superficie del ovario induce la transformación de la superficie.
El objetivo del experimento depende de la información que se requiera. La arquitectura del tejido, la morfología celular, y las tasas de crecimiento de las células son fácilmente controlables con los cortes de parafina. Por ejemplo, una sola capa de epitelio ovárico superficie se observa después de un cultivo en el suero libre αMEM durante 7 días (Figura 3), mientras que la adición de 5 mg / ml de insulina por 7 días induce hiperproliferación del epitelio superficial del ovario y la formación de múltiples capas de las células (Figura 3B). Mediante la adición de bromodesoxiuridina a los cultivos a una concentración final de 10 mM de 24 horas antes de la fijación, la proliferación de las células se puede medir (3A y 3B recuadro). De cultivos mantenidos en el suero libre αMEM, aproximadamente el 3-5% de OSE someterse a la proliferación durante el período de etiquetado de 24 horas (3A recuadro), mientras que un porcentaje mayor de la proliferación de células de la granulosa. Además de la insulina a la cultura de los medios de comunicación aumenta el porcentaje de la proliferación de OSE a aproximadamente el 30% del total de OSE (3B recuadro). Inmunofluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP) se pueden visualizar a través del gel de alginato con el microscopio estándar después de la transfección de cDNA (Figura 3C). Si bien la cultura proporciona alginato de órganos para el crecimiento y el análisis de la superficie de epitelio ovárico y los folículos primarios, cabe señalar que los folículos maduros, secundarios no llegan a sobrevivir en este sistema de cultivo (Figura 3D). Cultura de los folículos individuales a la madurez dentro de una matriz de hidrogel de alginato se ha descrito en otra parte 10.
Alteraciones en la proteína o ARN puede ser analizada desde el órgano completo o de tipos específicos de células con la degradación enzimática (Figura 4). El tratamiento de organoides de ovario cultivadas con colagenasa deja el estroma subyacente intacto (Figura 4 C) al tiempo que permite el enriquecimiento de OSE en el sedimento celular obtenido tras el tratamiento, aunque algunas células del estroma son aislados (Figura 4).
Figura 1. Ovario ratón tridimensional sistema de cultivo utilizado para propagar OSE después de la herida. A) Bajo el microscopio, la bolsa y la almohadilla de grasa alrededor se han eliminado. B) ovarios intactos (O) con el tubo del oviducto (T) y la almohadilla de grasa (F). C) Ovario con bolsa y la almohadilla de grasa extraída (izquierda) y desenrolló el oviducto (derecha). D) organoides ovario o del oviducto se colocaron en una gota de alginato. E) organoides alginato encerrado se deja caer en un entrecruzamiento solución de CaCl2 el alginato para formar un gel. F) El alginato encapsulado organoide de ovario. G) alginato encapsulado organoide oviducto. H) organoides alginato encapsulado incubadas en medio de cultivo.
Figura 2. Superficie regenerada por la superficie del ovario mide por citoqueratina 8. La encapsulación de los organoides de ovario por la OSE tras ser cortadas en cuartos octavos, y mitades, cultivadas en un medio de BSA, y se mide por el análisis de inmunohistoquímica con citoqueratina 8 (CK8) de anticuerpos.
Figura 3. Sistema de cultivo de alginato permite el paso de los factores de crecimiento y de la transfección de cDNA en el entorno de sistema operativo, pero no es compatible con un rápido crecimiento y maduración de los folículos. A) organoide ovario cultivadas durante 7 días en medio de base para analizar CK8 expresión, que marca el OSE. Sección de inserción, serial manchados de incorporación de BrdU. B) la adición de insulina al medio de cultivo induce hiperplasia de la OSE. Sección de inserción, serial manchados de incorporación de BrdU. C) organoide ovario transfectadas con cDNA de expresar las buenas prácticas agrarias. D) Sistema de alginato de la cultura apoya el crecimiento de folículos primordiales (rojo punta de flecha), pero no folículos secundarios maduros (flecha negro).
Figura 4. OSE puede ser aislado de la cultura siguiente análisis. A) organoide cultivaron en un medio para un máximo de 2 semanas. B) organoide encapsulado se trata con alginato liasa dejar organoide intacto. Ovario se tiñe con CK8 para marcar OSE. C) organoide es tratada con colagenasa a OSE separado del estroma subyacente. Pieza restante tejido teñido con CK8 para destacar la eliminación de la superficie del ovario. D) las células obtenidas después del tratamiento se enriquecen de OSE como manchas de CK8 (rojo). Las células son contrastados con DAPI para marcar los núcleos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
El desarrollo de un sistema de órganos en tres dimensiones utilizando los hidrogeles de alginato de la cultura representa un método versátil para el análisis de muchos tipos diferentes de tejidos a partir de una amplia variedad de organismos. El uso de cultivos en 3D se puede extender a los campos de la ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, ya que proporciona un andamio en el que las células pueden crecer 11. En la actualidad, nuestro laboratorio está pasando por los estudios iniciales con los ovarios y tejidos humanos, las trompas de Falopio, sin embargo, la cultura de los folículos de primates humanos y no humanos-ha sido descrita 12,13.
El uso de hidrogeles de alginato de organoides cultura ofrece varias ventajas sobre otros tipos de hidrogeles, como los que la incorporación de colágeno, fibrina o ácido hialurónico. Geles de alginato a temperatura ambiente y pH neutro, que prevé una mínima interrupción en el tejido como el gel encapsula el organoide 14. Alginato no reacciona con las proteínas celulares, proporcionando un soporte químicamente inerte para el crecimiento del tejido 5. El gel puede ser degrada enzimáticamente liasa con alginato, que no se degrada el tejido encapsulado, lo que permite la recuperación de las células en cultivo 15. Una de las desventajas de la utilización de hidrogeles de alginato para el cultivo de tejidos en tres dimensiones es que la reticulación iónica proporciona soporte mecánico para el hidrogel pierde estabilidad en el tiempo, lo que exige un período limitado la cultura y el entrecruzamiento de nuevo del alginato antes de la fijación 5. Aspectos críticos de este protocolo son el mantenimiento de la esterilidad durante todo el proceso de cultivo, así como una cuidadosa disección de los ovarios y el tejido del oviducto para evitar distorsiones de la morfología de los tejidos.
El ovario y el oviducto son especialmente adecuados para este método porque epitelio ovárico superficie cultivadas en plástico tradicionales de cultivo de células epiteliales se somete rápidamente a la transición mesenquimal, los cambios morfológicos, y la muerte celular a menos que inmortalizó, por ejemplo, la expresión de SV40 T / T antígeno o hTERT 16, 17. El pobre crecimiento de la OSE normal en plástico dificulta el análisis de posibles cambios pre-malignos. El sistema de cultivo de órganos también es compatible con el crecimiento del epitelio superficial del ovario o el epitelio del oviducto en contacto con las células del estroma subyacente, que puede jugar un papel en la fisiología normal y malignas de la cells18. La cultura de estos tipos de tejidos en los hidrogeles de alginato proporciona soporte mecánico para mantener la arquitectura tridimensional de los tejidos, mientras que el gel no interactúa con el 5 células.
El uso de este método para el cultivo de epitelio superficial del ovario o el epitelio del oviducto permite el análisis de los cambios moleculares y morfológicos debidos a manipulaciones aisladas de la cultura. El sistema de hidrogel de alginato permite el paso libre de transfectadas siRNA cDNA, y shRNA, así como las hormonas y factores de crecimiento 19. Mientras que la transfección transitoria no es específico de la OSE, ya que este tipo de células en la superficie externa de la eficiencia de transfección organoide más alto se alcanza en el entorno de sistema operativo en comparación con otros tipos de células en el interior del ovario, tales como células de la granulosa. Incorporación de bromodesoxiuridina durante el período de la cultura etiquetas células que se dividen por los cambios de control en el crecimiento celular en respuesta a las condiciones experimentales. Los cambios moleculares en el ARN o el nivel de proteínas, se puede determinar para dilucidar los mecanismos que conducen a cambios neoplásicos.
Aunque la etiología exacta del cáncer de ovario es desconocida, un aumento del número de ovulaciones vida han demostrado que se correlaciona con un mayor riesgo de cáncer de ovario 20. En el análisis in vivo de las hipótesis que une la ovulación para el cáncer de ovario presenta muchos desafíos en la determinación de las contribuciones de las gonadotropinas, la proliferación y la inflamación de la carcinogénesis 21-23. La cultura de alginato de hidrogel de los ovarios y oviductos permite la comparación aislada y directa de cada uno de estos componentes en el epitelio superficial del ovario y el oviducto epitelio, dando lugar a nueva información sobre el origen del cáncer de ovario y su progresión de las células normales a los tumores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
No hay nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Fondo de Investigación del Cáncer de ovario [conceder LT/UIC/01.2011], el Centro para la Ciencia UIC clínica y traslacional, el Centro de Cáncer de la UIC, y los Institutos Nacionales de Salud de subvención C06RR15482.
Los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices y normas establecidas por AAALAC en los protocolos aprobados por el cuidado de animales por el Cuidado de Animales y el empleo en la UIC. Los animales de este proyecto se encuentran en las salas de barrera en el Laboratorio de Biología de Recursos (BRL) de la Universidad de Illinois en Chicago. El BRL cuenta con un personal totalmente veterinario que supervisa los animales por lo menos dos veces al día y ofrece asesoramiento sobre cuidado de los animales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A.
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J.
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C.
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
