Summary
Coltura di cellule normali in loro contesto tridimensionale rappresenta un metodo alternativo per studiare eventi precoci necessari per la trasformazione cellulare e tumorigenesi. Questo metodo è utilizzato per la coltivazione ovarici normali e cellule oviductal per studiare eventi precoci nella formazione del cancro ovarico.
Abstract
Il cancro ovarico è la quinta causa di decessi per cancro nelle donne e ha un tasso di mortalità del 63% negli Stati Uniti 1. Il tipo di cellula d'origine dei tumori ovarici è ancora in discussione e potrebbe essere sia l'epitelio della superficie ovarica (OSE) o l'epitelio distale del fimbrie tube di Falloppio 2,3. Coltura le cellule normali come una coltura primaria in vitro consentirà agli scienziati di modello cambiamenti specifici che potrebbero portare al cancro ovarico nell'epitelio distinti, così definitivamente la determinazione del tipo di cellula di origine. Ciò permetterà lo sviluppo di biomarcatori più precisi, modelli animali con tessuto-specifici cambia gene, e migliori strategie di prevenzione mirate a questa malattia.
Il mantenimento di cellule normali in idrogel alginato promuove a breve termine in coltura in vitro di cellule nel loro contesto tridimensionale e permette l'introduzione di DNA plasmidico, siRNA e piccole molecole. Dagli organi coltura in pezzi che sono derivati da tagli strategici con un bisturi, le culture diverse da un singolo organo può essere generato, aumentando il numero di esperimenti da un singolo animale. Questi tagli aspetti del modello di ovulazione porta alla proliferazione di OSE, che è associata alla formazione di cancro ovarico. Tipi di cellule come l'OSE, che non crescono bene su superfici in plastica possono essere coltivate con questo metodo e facilitare l'indagine nei normali processi cellulari o dei primi eventi nella formazione del cancro 4.
Idrogel alginato può essere utilizzato per sostenere la crescita di molti tipi di tessuti 5. Alginato è un polisaccaride lineare composto da unità ripetute di β-D-mannuronico acido e α-L-guluronic acido che può essere reticolato con gli ioni calcio, con una conseguente azione gelificante delicata che non danneggiano i tessuti 6,7. Come per le altre cellule matrici tridimensionali cultura come Matrigel, alginato fornisce supporto meccanico per i tessuti, ma le proteine non sono reattivi con la matrice di alginato, e quindi le funzioni alginato come matrice extracellulare sintetico che non avvia segnalazione cellulare 5. L'idrogel alginato galleggia in media standard di coltura cellulare e supporta l'architettura della crescita dei tessuti in vitro.
Un metodo viene presentato per la preparazione, la separazione, e l'inclusione di neoplasie ovariche e composizioni per organo oviductal in idrogel alginato, che possono essere mantenute in coltura per un massimo di due settimane. Il rilascio enzimatico delle cellule per l'analisi di campioni di RNA e proteine dalla cultura organo è anche descritto. Infine, la crescita di tipi di cellule primarie è possibile senza immortalizzazione genetica di topi e permette agli investigatori di utilizzare knockout e topi transgenici.
Protocol
1. Ovarico dissezione e isolamento dei tessuti
- Preparare una soluzione allo 0,5% (w / v) di alginato di sodio, preparare da una versione modificata del protocollo descritto in precedenza 5, utilizzando PBS sterile e calore a 37 ° C. Miscelare invertendo o dondolo, ma non vortice. Disegnare la alginato in una siringa da 1 ml con un ago da 25 G e mantenere a 37 ° C.
- Preparare 10mM sterile CaCl 2 soluzione per la reticolazione alginato su incapsulamento dei tessuti e calda a 37 ° C.
- Preparare 1 ml di terreno di coltura (αMEM + 5 unità di penicillina e 5 mg / ml di streptomicina) per bene in un 24 pozzetti per ciascun esperimento. Comprendono diversi farmaci, peptidi, o virus nel terreno di coltura. Per la trasfezione prima di incapsulamento organo, incubare il tessuto con Lipofectamine il 2000 e il DNA plasmidico per quattro ore a 37 ° C.
- Sezionare gli organi dall'animale, rimuovere eventuali residui di tessuto adiposo o, staccare delicatamente la membrana che circonda la borsa ovarica, e tagliare l'ovaio o ovidotto in quattro pezzi da bisecando l'organo. Gli animali sono stati sacrificati dalla CO 2 asfissia seguita da dislocazione cervicale. Per l'ovidotto, delicatamente srotolare il tessuto tirando fuori le membrane di collegamento ed estendendo le estremità del tubo in direzioni opposte con pinze prima di tagliare.
- Inserire una singola goccia alginato (microlitri ~ 1-3) su una rete in fibra di sterilizzato.
- Utilizzando pinza sterile, spostare un pezzo di organo nella goccia alginato e il centro della goccia con pinza o un ago sterile.
- Invertire la goccia che contiene il pezzo d'organo (organoide) afferrando la rete in fibra con una pinza sterile e si rovescia per consentire la gravità di forzare l'alginato in una goccia.
- Toccare la pinza sul bordo di un piatto di 10 centimetri di Petri contenente 10mM CaCl 2 soluzione in modo che la goccia cade in soluzione.
- Incubare per 2 minuti, rimuovere con un cucchiaio di sterili contenenti pori di rilasciare supplementare 10mM CaCl 2, e trasferire nel terreno di coltura. Fino a quattro gel alginato può essere trasferito in un singolo pozzo di una piastra 24 pozzetti contenenti il terreno di coltura. Cultura per un periodo di tempo definito.
2. Degrado di alginato e la raccolta di cellule
- Per la solubilizzazione del gel alginato, incubare le culture in alginato liasi (3,4 mg / ml) disciolto in L-15 Leibovitz dei media a 37 ° C per 30 minuti o fino a quando il gel è completamente sciolto.
- Rimuovere il tessuto dal alginato liasi.
- Per la raccolta delle OSE, incubare il organoide con 500 unità di collagenasi in Leibovitz L-15 supporti per 1 ora 8. Vortex in 2 impulsi secondo (2 secondi e 2 secondi vortice di riposo) su media potenza per 1 minuto, seguito da 1 impulsi secondo (1 vortice secondo e 1 secondo riposo) per 1 minuto. Lasciate cadere a pezzi organo fondo della provetta e sopranatante pipetta in fresco provetta sterile. Centrifugare 3 minuti a 3000 rpm per epitelio superficie ovarica pellet.
- Per la raccolta dell'epitelio tubarico, tagliare il tubo della lunghezza e del luogo in plastica coltura in DMEM con 5 unità di penicillina e 5 mg / ml streptomicina e il 4% (v / v) di FBS. Più di 3-5 giorni, le cellule si "strisciare" fuori dello stroma tube e crescere in colture di tessuti plastic9.
3. Fissazione di culture organo alginato incapsulato per le sezioni di paraffina
- Raccogliere l'alginato incapsulato tallone dal terreno di coltura al punto di tempo selezionato.
- Recrosslink l'alginato per irrigidire il gel facendo cadere la cultura in sterili 10mM CaCl 2 soluzione per due minuti.
- Fissare l'organo alginato incapsulato nel 2% paraformaldeide saccarosio contenente 50 mm, 10 mm CaCl 2 e 50 mM di sodio cacodilato per garantire che il gel rimane solido e incapsula completamente il tessuto durante la fissazione.
- A seguito di lavorazione dei tessuti, incorporare l'intero alginato-incapsulato pezzo cultura d'organo in paraffina e sezione con un microtomo per generare 5 sezioni micron.
- L'alginato sarà sciolto e rimosso dalla diapositiva se si esegue l'immunoistochimica a causa del calore di recupero basato antigene. L'alginato resteranno e colorare per eosina in piedi e colorazione ematossilina eosina.
4. Rappresentante dei risultati:
Un esempio di tridimensionale cultura organo dell'ovaio e ovidotto è mostrata in Figura 1. Ovaie possono essere tagliati in pezzi di diverse dimensioni, e OSE proliferare e migrare per riparare la superficie che è stato ferito dalla incisione con il bisturi. Durante questo processo, il corretto orientamento della OSE rispetto al sottostante stroma è mantenuto, con l'OSE incapsulare l'ovaio. Come mostrato nella Figura 2, l'OSE di ovaie tagliati a metà incapsulare le ovaie in modo più completo rispetto a ovaie tagliato in quarti o ottavi. La riparazione delle ferite del ovaricosuperficie può essere studiata nel contesto delle ovaie e tutto può far luce su come riparare l'ovulazione e la superficie induce la trasformazione della superficie dell'ovaio.
L'endpoint dell'esperimento dipende dalle informazioni che è necessario. Architettura del tessuto, la morfologia cellulare e specifici tassi di crescita cellulare, possono essere facilmente monitorate utilizzando sezioni di paraffina. Ad esempio, un singolo strato di epitelio ovarico superficie si osserva dopo coltura nel siero senza αMEM per 7 giorni (Figura 3A), mentre l'aggiunta di 5 mg / ml di insulina per 7 giorni induce iperproliferazione dell'epitelio superficie ovarica e la formazione di strati multipli di cellule (Figura 3B). Aggiungendo bromodeossiuridina alle culture ad una concentrazione finale di 10 mM 24 ore prima della fissazione, la proliferazione delle cellule può essere misurata (inserto 3A e 3B). Per le culture mantenuto nel siero senza αMEM, circa il 3-5% di OSE subire proliferazione durante il periodo di 24 ore di etichettatura (3A riquadro), mentre una percentuale maggiore di cellule della granulosa proliferano. L'aggiunta di insulina per la cultura dei media aumenta la percentuale di proliferazione OSE a circa il 30% del totale OSE (3B riquadro). Immunofluorescenza di proteina fluorescente verde (GFP) possono essere visualizzati attraverso il gel alginato con microscopia seguente norma trasfezione del DNA (Figura 3C). Mentre organo cultura alginato offre per la crescita e l'analisi dell'epitelio ovarico superficie e follicoli primari, si deve rilevare che la maturità, i follicoli secondari non riescono a sopravvivere in questo sistema di coltura (Fig. 3D). Cultura dei follicoli singoli maturità all'interno di una matrice idrogel alginato è stata descritta altrove 10.
Alterazioni di proteine o RNA può essere analizzata da l'intero organo o da specifici tipi cellulari mediante degradazione enzimatica (Figura 4). Trattamento di organoidi ovarico coltura con collagenasi lascia intatto lo stroma sottostante (Figura 4C), pur consentendo l'arricchimento di OSE nel pellet ottenuto dopo il trattamento, anche se alcune cellule stromali sono anche isolate (fig. 4D).
Figura 1. Dell'ovaio mouse tridimensionale sistema di coltura utilizzato per propagare OSE dopo il ferimento. A) Sotto il microscopio, la borsa e il cuscinetto di grasso che circonda sono stati rimossi. B) ovaio intatto (O) con tubo oviductal (T) e grassi pad (F). C) ovaio con borsa e cuscinetto adiposo rimosso (a sinistra) e srotolato ovidotto (a destra). D) organoidi ovarica o oviductal sono stati collocati in una gocciolina alginato. E) organoidi alginato racchiusi furono rinviati ad una soluzione di CaCl 2 reticolazione l'alginato di formare un gel. F) alginato incapsulato organoide ovarico. G) alginato incapsulato organoide oviductal. H) organoidi alginato incapsulato incubati in terreno di coltura.
Figura 2. Superficie rigenerato dalla superficie ovarica misurata con citocheratina 8. Incapsulamento di organoidi ovarico dal OSE dopo essere stato tagliato in ottavi, quarti, e la metà, coltivate in media BSA, e misurato attraverso l'analisi immunoistochimica utilizzando citocheratina 8 (CK8) anticorpi.
Figura 3. Sistema di coltura alginato permette il passaggio di fattori di crescita e di trasfezione di cDNA nel OSE, ma non supporta una rapida crescita e la maturazione dei follicoli. A) organoide ovarica in coltura per 7 giorni in media basale analizzati per CK8 espressione, che segna l'OSE. Incasso, sezione seriale macchiato per incorporazione di BrdU. B) L'aggiunta di insulina per i terreni di coltura induce iperplasia delle OSE. Incasso, sezione seriale macchiato per incorporazione di BrdU. C) organoide ovarica transfettate con cDNA per esprimere la GFP. D) la cultura del sistema alginato sostiene la crescita dei follicoli primordiali (freccia rossa), ma follicoli secondari non maturi (freccia nera).
Figura 4. OSE possono essere isolati per la cultura successiva analisi. A) organoide coltivate in media per un massimo di 2 settimane. B) organoide incapsulato è trattato con alginato liasi di lasciare organoide intatto. Dell'ovaio è macchiato con CK8 per segnare OSE. C) organoide è trattato con collagenasi di OSE separato da stroma sottostante. Pezzo rimanente tessuto era macchiata di CK8 per evidenziare la rimozione della superficie dell'ovaio. D) le cellule raccolte dopo il trattamento sono arricchiti per OSE come colorate per CK8 (rosso). Le cellule sono di contrasto con DAPI per marcare i nuclei.
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Discussion
Lo sviluppo di un sistema tridimensionale di organi cultura utilizzando idrogel alginato rappresenta un metodo versatile per l'analisi di molti tipi di tessuto diverso da una grande varietà di organismi. L'uso di colture 3D può essere estesa ai campi della ingegneria dei tessuti e medicina rigenerativa in quanto fornisce una impalcatura su cui le cellule possono crescere 11. Attualmente, il nostro laboratorio è in fase di studio iniziale, usando il tessuto ovarico umano e tube di Falloppio, tuttavia, la cultura dei follicoli dei primati umani e non umani è stato descritto 12,13.
L'uso di idrogel alginato di organoidi cultura offre diversi vantaggi rispetto ad altri tipi di idrogel, come quelli che incorporano collagene, fibrina, o acido ialuronico. Gel alginato a temperatura ambiente e pH neutro, che prevede un minor sconvolgimento dei tessuti come il gel incapsula il organoide 14. Alginato non reagisce con le proteine cellulari, fornendo un supporto chimicamente inerte per la crescita del tessuto 5. Il gel può essere enzimaticamente degradata alginato liasi usando, che non degradano il tessuto incapsulato, consentendo il recupero di cellule in coltura 15. Uno svantaggio dell'uso di alginato di idrogel tridimensionale coltura tissutale è che la reticolazione ionica che fornisce supporto meccanico per l'idrogel perde stabilità nel tempo, necessitano di periodi di limitata cultura e ri-reticolazione del alginato prima di fissaggio 5. Aspetti critici di questo protocollo sono mantenendo la sterilità durante tutto il processo della cultura, così come dissezione attenta del tessuto ovarico e oviductal per evitare interruzioni della morfologia del tessuto.
L'ovaio e ovidotto sono particolarmente adatti a questo metodo perché la superficie epiteliale ovarico colto in plastica tradizionale coltura delle cellule epiteliali subisce rapidamente alla transizione mesenchimali, cambiamenti morfologici, e la morte cellulare a meno immortalata, ad esempio con l'espressione di SV40 T / T antigene o hTERT 16, 17. Scarsa crescita della OSE normale su plastica ostacola l'analisi di potenzialmente pre-cancerose modifiche. Il sistema di coltura d'organo supporta anche la crescita della superficie dell'epitelio ovarico o epitelio oviductal in contatto con le cellule stromali sottostante, che può giocare un ruolo nella fisiologia normale e maligna del cells18. Cultura di questi tipi di tessuto in idrogel alginato fornisce supporto meccanico per mantenere l'architettura tridimensionale del tessuto, mentre lo stesso gel non interagisce con le cellule 5.
Usando questo metodo per epitelio superficie ovarica coltura o epitelio oviductal permette l'analisi dei cambiamenti molecolari e morfologiche derivanti da manipolazioni isolato della cultura. Il sistema di idrogel alginato permette il libero passaggio di transfettate cDNA, siRNA e shRNA, così come gli ormoni e fattori di crescita 19. Mentre trasfezione transiente non è specifico per l'OSE, perché questo tipo di cellule è sulla superficie esterna del rendimento organoide trasfezione superiore è realizzato in OSE rispetto ad altri tipi di cellule all'interno delle ovaie, come le cellule della granulosa. Incorporazione di bromodeossiuridina durante etichette periodo la cultura divisione delle cellule monitorando i cambiamenti nella crescita cellulare in risposta alle condizioni sperimentali. Cambiamenti molecolari a livello di RNA o di proteine può essere determinato a chiarire i meccanismi che porta a alterazioni neoplastiche.
Mentre l'eziologia precisa di cancro ovarico è sconosciuta, un maggior numero di ovulazioni corso della vita sono risultati correlati ad un aumentato rischio di cancro ovarico 20. L'analisi in vivo di ipotesi che collegano l'ovulazione al cancro ovarico presenta molte sfide nel determinare i contributi dei gonadotropine, la proliferazione, e l'infiammazione alla carcinogenesi 21-23. Idrogel cultura alginato di ovaie e tube permette di isolato, il confronto diretto di ciascuno di questi componenti a livello dell'epitelio superficie epiteliale ovarico e oviductal, portando a nuove informazioni circa l'origine del cancro ovarico e la sua progressione da cellule normali a tumori.
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Disclosures
Non c'è nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Fondo di Ricerca sul Cancro ovarico [concedere LT/UIC/01.2011], il Centro UIC per la scienza clinica e traslazionale, il Cancer Center UIC, e il National Institutes of Health concedere C06RR15482.
Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e dei regolamenti previsti dal AAALAC sotto protocolli animali approvati cura dalla cura degli animali e del Comitato Usa a UIC. Animali per questo progetto sono alloggiati in camere barriera nel Laboratorio risorse biologiche (BRL) presso l'Università dell'Illinois a Chicago. Il BRL dispone di uno staff completamente veterinario che controlla gli animali, almeno due volte al giorno e fornisce consigli sulla cura degli animali.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
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