Summary
Культура нормальных клеток в трехмерном контексте представляет альтернативный метод для изучения ранних событий, необходимых для сотовых трансформации и опухолей. Этот метод используется для выращивания нормального яичника и яйцевода клетках для изучения ранних событий в яичниках образование рака.
Protocol
1. Рассечение тканей яичников и изоляции
- Подготовка 0,5% (вес / объем) раствор альгината натрия, готовят из модифицированную версию протокола описано выше 5, используя стерильные PBS и теплом до 37 ° C. Смешайте обращением или раскачивание, но не вихря. Нарисуйте альгината в 1 мл шприц с иглой 25 G и поддерживать при температуре 37 ° C.
- Подготовка 10 мМ CaCl 2 стерильный раствор для сшивания альгината на ткани инкапсуляции и теплой до 37 ° C.
- Подготовка 1 мл культуральной среды (αMEM + 5 единиц пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина) на лунку в 24-луночный планшет для каждого эксперимента. Включите различные препараты, пептиды, или вирусы в культуральной среде. Для трансфекции до органа инкапсуляции, инкубировать ткани с Lipofectamine 2000 и плазмидной ДНК в течение четырех часов при температуре 37 ° C.
- Рассеките органов у животных, удалить любой жир или остаточной ткани, аккуратно снять мембраны сумки окружающей яичники, и сократить яичников или яйцевод на четыре части по рассекает органа. Животные были подвергнуты эвтаназии СО 2 удушья следует шейки дислокации. Для яйцевода, осторожно разматывать ткань, потянув за исключением подключения мембран и расширение концах трубки в противоположных направлениях, с использованием щипцов перед сокращением.
- Место одной капли альгинат (~ 1-3 мкл) на стерилизованное сетки волокна.
- Использование стерильного пинцета, перенести часть орган в капле альгинат и в центре капли использованием щипцов или стерильной иглой.
- Обратить капли содержащие органа кусок (органоид), держа сетку волокна стерильным пинцетом и превращение его с ног на голову, чтобы заставить тяжести альгината в висячей капли.
- Нажмите пинцетом по краю блюда 10см Петри с 10 мМ CaCl 2 решения так, чтобы капля попадает в раствор.
- Инкубируйте в течение 2 минут, снимите с ложкой стерильный содержащих поры выпустить дополнительные 10 мМ CaCl 2, и передачи в культуральной среде. До четырех гелей альгината могут быть перенесены в одну лунку 24-луночный планшет содержащая питательной среды. Культура для определенного периода времени.
2. Деградация альгинат и сбора клеток
- Для солюбилизации альгинат гель, инкубировать культур в альгинат лиазы (3,4 мг / мл), растворенных в L-15 Лейбовиц медиа-при 37 ° С в течение 30 минут или пока гель полностью не растворится.
- Удаление ткани из альгината лиазы.
- Для сбора OSE, инкубировать органоид с 500 единиц коллагеназы в L-15 Лейбовиц средств массовой информации в течение 1 часа 8. Вихря в 2 секунды импульсов (2 секунды вихрь и 2 секундная пауза) на средней мощности в течение 1 минуты, а затем на 1 секунду импульсов (1 секунда вихря и 1 секунду отдыха) в течение 1 минуты. Давайте орган части приходятся на нижнюю часть трубки и пипетки микроцентрифужных супернатант в свежую стерильную пробирку микроцентрифужных. Центрифуга 3 минуты при 3000 оборотов в минуту до гранул поверхности эпителия яичников.
- Для сбора трубного эпителия, вырезать трубки в длину и место на культуре ткани пластика в DMEM с 5 единиц пенициллина и 5 мкг / мл стрептомицина и 4% (объем / объем) FBS. За 3-5 дней, клетки будут "ползти" из трубной стромы и растут на культуре ткани plastic9.
3. Фиксация альгинат инкапсулированные культуры орган для парафиновых срезов
- Сбор альгинат инкапсулированные бусину из культуральной среды на отдельных момент времени.
- Recrosslink альгинат ужесточить геля путем отказа от культуры в стерильные 10 мМ CaCl 2 решение в течение двух минут.
- Fix альгинат инкапсулированные орган в 2% параформальдегида, содержащий 50 мМ сахарозы, 10 мМ CaCl 2 и 50 ммоль натрия какодилатном чтобы гель остается твердой и полностью инкапсулирует ткани во время фиксации.
- После обработки ткани, вставлять весь альгинат-инкапсулированные органной культуры кусок в парафин и раздел с микротома генерировать 5 мкм разделов.
- Альгината будет распущен и удаляется из слайдов, если выполнение иммуногистохимического за счет тепла, основанные поиска антигена. Альгинат останется и пятна на эозином под стоящий гематоксилином и эозином окрашивания.
4. Представитель Результаты:
Примером трехмерного органа культуры яичников и маточных труб показано на рисунке 1. Яичники может быть разрезана на различные части размера и OSE размножаться и мигрировать на ремонт поверхности, которая была ранена из разрез скальпелем. Во время этого процесса, правильной ориентации OSE по отношению к основной стромы сохраняется, с OSE инкапсуляции яичника. Как показано на рисунке 2, OSE яичников разрезать пополам инкапсуляции яичников более полно по сравнению с яичниками разрезать на четверти или восьмыми. Рана ремонт яичниковповерхности могут быть изучены в контексте всего яичника и может пролить свет на процесс овуляции и ремонт поверхности вызывает превращение яичников поверхности.
Конечная точка эксперимента зависит от информации, которая требуется. Ткань архитектуры, клеточной морфологии и специфический клеточный рост легко контролировать с помощью парафиновых срезов. Например, один слой яичников поверхности эпителия наблюдается после культивирования в бессывороточной αMEM в течение 7 дней (рис. 3А), а добавлением 5 мкг / мл инсулина в течение 7 дней вызывает гиперпролиферацию эпителия яичников поверхности и формирование из нескольких слоев клетки (рис. 3В). Добавляя к бромдезоксиуридин культур в конечной концентрации 10 мкМ 24 часа до фиксации, пролиферацию клеток могут быть измерены (вставка 3A и 3B). Для культур поддерживается в бессывороточной αMEM, примерно 3-5% от OSE пройти распространения в течение 24 часов маркировки период (вставка 3А), в то время как больший процент клеток гранулезы размножаться. Добавление инсулина для питательных сред увеличивает процент пролиферирующих OSE приблизительно 30% от общего числа OSE (вставка 3B). Иммунофлуоресценции зеленого флуоресцентного белка (GFP) можно представить через гель альгината со стандартной микроскопии следующие кДНК трансфекции (рис. 3С). Хотя культура альгинат орган обеспечивает рост и анализа поверхности эпителия яичников и первичных фолликулов, следует отметить, что зрелые, вторичные фолликулы не могут выжить в этой системе культуры (рис. 3D). Культура отдельных фолликулов к погашению в течение матрица гидрогеля альгинат была описана в другом месте 10.
Изменения в белок или РНК могут быть проанализированы с весь орган или от определенных типов клеток с использованием ферментативного расщепления (рис. 4). Лечение культурный органоидов яичников с коллагеназы листьев основные стромы нетронутыми (рис. 4С), позволяя для обогащения OSE в осадок клеток, полученных после лечения, хотя некоторые из стромальных клеток, также изолированы (рис. 4D).
Рисунок 1. Мышь яичников трехмерные культуры система, используемая для распространения OSE после ранения. А) Под микроскопом, сумки и окружающей жировой ткани были удалены. Б) Неповрежденная яичников (O) с яйцевода трубки (Т) и жировая ткань (F). С) Завязь с бурсы и жировая ткань удаляется (слева) и развернутой яйцевода (справа). D) яичников или яйцеклада органоиды были помещены в альгинат капли. Е) альгинат заключенная органоиды были сброшены в CaCl 2 решения сшивания альгината с образованием геля. F) альгинат инкапсулированные яичников органоид. G) альгинат инкапсулированные яйцевода органоид. H) альгинат инкапсулированные органоидов инкубировали в культуральной среде.
Рисунок 2. Площадь возрожден яичников поверхности измеряется цитокератин 8. Инкапсуляция яичников органоидов по OSE после того, как разрезать на восьмые, четверти и половины, культивировали в среде BSA, и измеряется иммуногистохимического анализа с использованием цитокератин 8 (CK8) антител.
Рисунок 3. Альгинат культуры система позволяет прохождение факторов роста и трансфекции кДНК в операционной среде, но не поддерживает быстрый рост и созревание фолликулов. ) Яичников органоид культивировали в течение 7 дней в базальной среды проанализированы CK8 выражение, которое знаменует OSE. Врезка, серийный разделе витражи для включения BrdU. Б) дополнение инсулина для питательных сред вызывает гиперплазию OSE. Врезка, серийный разделе витражи для включения BrdU. С) яичников органоид трансфицированных кДНК выразить GFP. D) система альгинат культуры поддерживает рост первичных фолликулов (красная стрелка), но не зрелых вторичных фолликулов (черная стрелка).
Рисунок 4. OSE могут быть выделены для анализа следующие культуры. ) Органоид культивировали в среде до 2 недель. Б) Encapsulated органоид обрабатывают альгинат лиазы оставить органоид нетронутыми. Завязь окрашивали CK8 отметить OSE. С) органоид обрабатывают коллагеназы отделить от основного OSE стромы. Оставшийся кусок ткани окрашивали CK8 выделить удаление яичников поверхности. D) Сборник клеток после лечения обогащенные для OSE, как окрашивают в течение CK8 (красный). Клетки контрастно с DAPI, чтобы отметить ядер.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Развитие трехмерной органной культуры система, учитывающая альгинат гидрогелей представляет универсальный метод для анализа различных типов тканей от самых разнообразных организмов. Использование 3D-культур может быть распространено на области тканевой инженерии и регенеративной медицины, поскольку она обеспечивает эшафот, на котором клетки могут расти 11. В настоящее время наша лаборатория проходит начальные исследования с использованием человеческих яичников и маточных тканей трубки, однако культуре человеческих и не человеческих приматов фолликулов была описана 12,13.
Использование альгината гидрогелей к культуре органоидов имеет ряд преимуществ перед другими видами гидрогели, такие как включение коллагена, фибрина, или гиалуроновой кислоты. Альгинат гели при комнатной температуре и нейтральный рН, обеспечивая для маленьких нарушения тканей, как гель инкапсулирует органоид 14. Альгинат не реагирует с клеточными белками, обеспечивая химически инертный поддержка роста тканей 5. Гель можно ферментативно деградированных использованием альгината лиазы, который не ухудшает инкапсулированные ткани, что позволяет для поиска культивируемых клеток 15. Одним из недостатков использования гидрогелей альгината для трехмерных тканевых культур является то, что ионные сшивания предоставления механическую поддержку для гидрогеля теряет устойчивость с течением времени, что требует ограниченного периода культуры и повторно сшивания альгината до фиксации 5. Критические аспекты этого протокола поддержания стерильности всей культуры процесс, а также тщательного вскрытия яичника и яйцевода ткани, чтобы предотвратить сбои в ткани морфологии.
Яичника и яйцевода особенно подходят для этого метода, поскольку поверхностного эпителия яичников культивировали на традиционных пластиковых культуры клеток эпителия быстро проходит, чтобы переход мезенхимальных, морфологические изменения, и клеточной смерти, если не увековечена, например, выражение SV40 T / T антигена или hTERT 16, 17. Бедный рост нормальной операционной среде на пластиковые затрудняет анализ потенциально предварительно злокачественных изменений. Системы органов культуры также поддерживает рост эпителия яичников поверхности эпителия или яйцеклада в контакте с основной стромальные клетки, которые могут играть роль в нормальных и злокачественных физиологии cells18. Культура этих типов тканей в альгинат гидрогелей обеспечивает механическую поддержку для поддержания трехмерной архитектуры ткани, в то время как гель сам по себе не взаимодействуют с клетками 5.
Используя этот метод для культивирования яичников поверхности эпителия или яйцеклада эпителия позволяет для анализа молекулярных и морфологических изменений, вытекающих из изолированных манипуляций культуры. Система альгинат гидрогель позволяет свободный проход трансфекции кДНК, миРНК и shRNA, а также гормонов и факторов роста 19. Хотя временной трансфекции не является специфичной для операционной среде, потому что этот тип клеток находится на внешней поверхности органоид выше трансфекции эффективность достигается в операционной среде по сравнению с другими типами клеток в интерьере яичников, таких как клетки гранулезы. Включение бромдезоксиуридин во время периода культивирования этикетки делящихся клеток путем мониторинга изменений в рост клеток в ответ на экспериментальных условиях. Молекулярные изменения в РНК или белка может быть определена выяснить механизмы, приводящие к опухолевой изменения.
Хотя точная этиология рака яичников неизвестна, увеличение количества жизни овуляции, как было показано, коррелирует с повышенным риском развития рака яичников 20. В естественных условиях анализ гипотез связей овуляции рак яичников представляет много проблем при определении вклада гонадотропинов, пролиферации и воспаления в канцерогенезе 21-23. Альгинат гидрогеля культуры яичников и маточных труб позволяет изолированы, прямое сравнение каждого из этих компонентов в эпителии яичника и яйцевода поверхности эпителия, что приводит к новой информации о происхождении рака яичников и ее развитие от нормальных клеток к опухолям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Существует ничего разглашать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана исследования рака яичников фонд [грант LT/UIC/01.2011], МСЖД центр клинической и поступательного науки, МСЖД онкологический центр, Национальный институт здоровья грант C06RR15482.
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами установленными AAALAC рамках утвержденных по уходу за животными протоколов уходу и использованию животных комитетом на МСЖД. Животные для этого проекта размещены в барьер номеров в биологических ресурсов лаборатории (BRL) в университете штата Иллинойс в Чикаго. BRL имеет полностью ветеринарного персонала, который контролирует животных по крайней мере два раза в день и дает рекомендации по уходу за животными.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A.
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J.
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C.
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
