Summary
Cultura de células normais em seu contexto tridimensional representa um método alternativo para estudar os eventos iniciais necessárias para a transformação celular e tumorigênese. Este método é usado para crescer ovariano normal e células oviductal para estudar os eventos iniciais na formação de câncer de ovário.
Abstract
Câncer de ovário é a quinta causa de morte por câncer em mulheres e tem uma taxa de mortalidade de 63% nos Estados Unidos 1. O tipo de célula de origem para o câncer de ovário ainda está em questão e pode ser tanto o epitélio de superfície do ovário (OSE) ou do epitélio distal do fímbrias tuba uterina 2,3. Cultura as células normais como uma cultura primária in vitro permitirá aos cientistas modelo de mudanças específicas que podem levar ao câncer de ovário no epitélio distintas, assim, definitivamente determinar o tipo de célula de origem. Isto irá permitir o desenvolvimento de biomarcadores mais precisos, modelos animais com alterações de tecidos específicos de genes, e das melhores estratégias de prevenção específicas para esta doença.
Manter as células normais em hidrogéis de alginato promove a curto prazo na cultura in vitro de células no seu contexto tridimensional e permite introdução de DNA plasmídeo, siRNA, e pequenas moléculas. Pelos órgãos de cultura em pedaços que são derivados de cortes estratégicos usando um bisturi, várias culturas a partir de um único órgão podem ser gerados, aumentando o número de experimentos a partir de um único animal. Estes cortes aspectos do modelo da ovulação levando a proliferação da OSE, que está associado com a formação de câncer de ovário. Tipos de células, como a OSE, que não crescem bem em superfícies de plástico podem ser cultivadas usando este método e facilitar a investigação sobre os processos celulares normais ou os primeiros eventos na formação do câncer 4.
Hidrogéis de alginato pode ser usado para suportar o crescimento de muitos tipos de tecidos 5. Alginato é um polissacarídeo linear composto por unidades repetitivas de ácido D-mannuronic β e α-L-ácido gulurônico que podem ser reticulados com íons de cálcio, resultando em uma ação gelificante suave que não danificar os tecidos 6,7. Como outras matrizes tridimensionais de cultura de células, tais como Matrigel, alginato fornece suporte mecânico para os tecidos, no entanto, as proteínas não são reativos com a matriz de alginato e, portanto, funções de alginato como uma matriz extracelular sintética que não inicia sinalização celular 5. O hidrogel de alginato flutua no meio padrão de cultura celular e suporta a arquitetura do crescimento de tecidos in vitro.
Um método é apresentado para a preparação, separação e incorporação de ovário e pedaços de órgãos oviductal em hidrogéis de alginato, que pode ser mantidas em cultura por até duas semanas. A liberação enzimática de células para análise de proteínas e amostras de RNA a partir da cultura de órgãos é também descrito. Finalmente, o crescimento de tipos de células primárias é possível sem imortalização genética de ratos e permite que os pesquisadores de usar nocaute e camundongos transgênicos.
Protocol
1. Dissecção e isolamento do tecido ovariano
- Preparar uma solução 0,5% (w / v) de alginato de sódio, prepare de uma versão modificada do protocolo descrito anteriormente 5, usando PBS estéril e calor a 37 ° C. Misture por inversão ou de balanço, mas não vortex. Desenhe o alginato em uma seringa de 1 ml com agulha 25 G e manter a 37 ° C.
- Prepare estéril 10mM CaCl 2 solução para o alginato de reticulação em encapsulamento dos tecidos e quente a 37 ° C.
- Prepare 1mL de meio de cultura (αMEM + 5 unidades de penicilina e estreptomicina 5 mg / ml) por bem em uma placa de 24 poços para cada experimento. Incluem vários fármacos, peptídeos ou vírus no meio de cultura. Para transfecção antes de encapsulamento de órgãos, tecidos incube com Lipofectamine 2000 e DNA plasmidial por quatro horas a 37 ° C.
- Dissecar os órgãos do animal, remover qualquer tecido adiposo ou residual, puxe fora da membrana bursa redor do ovário, e cortar o ovário ou oviduto em quatro pedaços por que atravessa o órgão. Animais foram sacrificados por asfixia CO 2 seguido por deslocamento cervical. Para o oviduto, gentilmente desenrolar o tecido puxando para além das membranas de ligação e estendendo as extremidades do tubo em direções opostas com a pinça antes de cortar.
- Coloque uma gota de alginato única (~ mL 1-3) em um de malha de fibra esterilizados.
- Utilizando uma pinça estéril, mover uma peça de órgão no gota de alginato e do centro da gotícula usando uma pinça ou uma agulha esterilizada.
- Inverter a gota contendo o pedaço de órgãos (organóides) segurando os de malha de fibra com uma pinça estéril e transformá-lo de cabeça para baixo para permitir que a gravidade para forçar o alginato em uma gota de suspensão.
- Toque a pinça na borda de um prato de petri contendo 10 centímetros 10mM CaCl 2 solução de modo que a gota cai em solução.
- Incubar por 2 minutos, retire com uma colher estéreis, contendo poros para liberar extras 10mM CaCl 2, e transferir para o meio de cultura. Até quatro géis de alginato podem ser transferidos para um único poço de uma placa de 24 poços contendo meio de cultura. Cultura por um período de tempo definido.
2. Degradação de alginato e coleta de células
- Para a solubilização do gel de alginato, incubar as culturas em liase alginato (3,4 mg / ml) dissolvido em L-15 Leibovitz media a 37 ° C por 30 minutos ou até gel é completamente dissolvido.
- Remover o tecido da liase alginato.
- Para a coleta da OSE, incubar os organóides com 500 unidades de colagenase em L-15 Leibovitz da mídia por 1 hora 8. Vortex em 2 pulsos segundo (2 segundos vortex e 2 segundos de descanso) em potência média por 1 minuto, seguido por um segundo pulsos (1 vortex segundo e um resto segundo) por 1 minuto. Deixe pedaços de órgãos caem ao fundo do tubo de microcentrífuga e sobrenadante pipeta no tubo de microcentrífuga estéril fresco. Centrífuga 3 minutos a 3000 rpm para sedimentar epitélio de superfície do ovário.
- Para a coleta do epitélio tubário, cortar o tubo comprido e coloque em plástico de cultura de tecidos em DMEM com 5 unidades de penicilina e 5 mg / ml de estreptomicina e 4% (v / v) FBS. Mais de 3-5 dias, as células vão "arrastar" para fora do estroma tubária e crescer em cultura de tecidos plastic9.
3. Fixação de culturas alginato encapsulado órgão para parafina
- Recolher o alginato encapsulado pérola do meio de cultura no ponto de tempo selecionado.
- Recrosslink o alginato para endurecer o gel, largando a cultura estéril em 10mM CaCl 2 solução por dois minutos.
- Corrigir o órgão alginato encapsulado em paraformaldeído 2% contendo 50 mM de sacarose, 10 mM CaCl 2 e 50 mM cacodilato de sódio para garantir que o gel permanece sólida e totalmente encapsula tecido durante a fixação.
- Após processamento de tecidos, incorporar todo o alginato encapsulado pedaço da cultura de órgãos em parafina e corte com um micrótomo para gerar 5 seções mM.
- O alginato será dissolvido e removido do slide se realizar imunohistoquímica devido ao calor recuperação antigênica baseada. O alginato permanecerá e mancha de eosina compreensão hematoxilina e eosina.
4. Resultados representativos:
Um exemplo de uma cultura de órgãos em três dimensões do ovário e oviduto é mostrado na Figura 1. Ovários podem ser cortados em pedaços de tamanhos diferentes, e OSE proliferar e migrar para reparar a superfície que foi ferido a partir da incisão com o bisturi. Durante este processo, a orientação correta da OSE em relação ao estroma subjacente é mantida, com a OSE encapsular o ovário. Conforme mostrado na Figura 2, a OSE dos ovários cortado ao meio encapsular o ovário de forma mais completa em comparação com ovários cortado em quartos ou oitavos. O reparo de feridas do ováriosuperfície podem ser estudadas no contexto do ovário inteiro e pode lançar luz sobre como reparar a ovulação ea superfície induz a transformação da superfície do ovário.
O ponto final do experimento depende da informação que é necessário. Arquitetura do tecido, a morfologia celular, e taxas específicas de crescimento celular são facilmente monitoradas utilizando-se secções de parafina. Por exemplo, uma única camada de epitélio de superfície do ovário é observada após o cultivo em soro livre de αMEM por 7 dias (Figura 3A) enquanto que a adição de 5 mg / ml de insulina por 7 dias induz hiperproliferação do epitélio de superfície ovariano e formação de camadas múltiplas de células (Figura 3B). Adicionando bromodeoxiuridina para as culturas em uma concentração final de 10 mM 24 hr antes da fixação, a proliferação de células pode ser medido (3A e 3B inset). Para culturas mantidas em soro livre de αMEM, cerca de 3-5% da OSE sofrem proliferação durante o período de rotulagem 24 horas (3A inset), enquanto uma porcentagem maior de células da granulosa proliferam. Além de insulina para a cultura de mídia aumenta a porcentagem de proliferação OSE a aproximadamente 30% da OSE total (3B inset). Imunofluorescência da proteína verde fluorescente (GFP) podem ser visualizados através do gel de alginato com microscopia seguinte norma transfecção cDNA (Figura 3C). Enquanto a cultura de órgãos alginato prevê crescimento e análise de superfície epitélio ovariano e folículos primários, deve-se notar que a madura, folículos secundários não sobreviver neste sistema de cultivo (Figura 3D). Cultura de folículos individuais de maturidade dentro de uma matriz de hidrogel de alginato tem sido descrito em outros lugares 10.
Alterações na proteína ou RNA pode ser analisado a partir de todo o órgão ou a partir de tipos específicos de células usando degradação enzimática (Figura 4). Tratamento de ovário Organóides cultivados com colagenase deixa o estroma subjacente intacto (Figura 4C), permitindo para o enriquecimento da OSE na célula pellet obtido após o tratamento, apesar de algumas células do estroma também estão isolados (Figura 4D).
Figura 1. Rato ovário sistema de cultura tridimensional usado para propagar OSE após ferindo. A) Sob o microscópio, a bursa ea almofada de gordura ao redor foram removidos. B) ovário intacto (O) com tubo oviductal (T) e gordura pad (F). C) Ovário com bursa e gordura abdominal removido (à esquerda) e desenrolado oviduto (direita). D) Organóides ovário ou oviductal foram colocados em uma gota de alginato. E) Organóides alginato envolto foram lançadas em uma solução de CaCl 2 crosslinking do alginato para formar um gel. F) alginato encapsulado organóides de ovário. G) alginato encapsulado organóides oviductal. H) Organóides alginato encapsulado incubadas em meio de cultura.
Figura 2. Superfície regenerado pela superfície do ovário medido pelo citoqueratina 8. Encapsulamento de Organóides ovário pela OSE depois de ser cortado em oitavos, quartos e metades, cultivadas em meio BSA, e medido pela análise imuno-histoquímica usando citoqueratina 8 (CK8) de anticorpos.
Figura 3. Alginato sistema de cultura permite a passagem de fatores de crescimento e transfecção de cDNA para a OSE, mas não suporta o rápido crescimento e maturação dos folículos. A) organóides ovário cultivadas por 7 dias em meio basal analisadas para CK8 expressão, que marca o OSE. Seção, Inset série coradas para incorporação de BrdU. B) Adição de insulina ao meio de cultura induz hiperplasia da OSE. Seção, Inset série coradas para incorporação de BrdU. C) organóides ovário transfectadas com cDNA para expressar GFP. D) sistema de cultura alginato suporta o crescimento de folículos primordiais (vermelho ponta de seta), mas não maduro folículos secundários (seta preta).
Figura 4. OSE pode ser isolado para a cultura seguinte análise. A) organóides cultivadas em meio por até duas semanas. B) organóides Encapsulated é tratada com liase alginato de deixar organóides intacta. Ovário é manchada com CK8 para marcar OSE. C) organóides é tratada com colagenase a OSE separado do estroma subjacente. Pedaço de tecido remanescente foi corado com CK8 para destacar a remoção da superfície do ovário. D) as células coletadas após o tratamento são enriquecidos por OSE como coradas para CK8 (vermelho). Células são contracorados com DAPI para marcar núcleos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O desenvolvimento de um sistema de cultura tridimensional de órgãos utilizando hidrogéis de alginato representa um método versátil para a análise de muitos tipos de tecidos diferentes de uma grande variedade de organismos. O uso de culturas 3D pode ser estendido para os campos da engenharia de tecidos e medicina regenerativa, pois proporciona um andaime sobre o qual as células podem crescer 11. Atualmente, nosso laboratório está passando por estudos iniciais usando de ovário e de tecidos humanos trompa de Falópio, no entanto, a cultura dos direitos humanos e não humanos folículos de primatas tem sido descrita 12,13.
O uso de hidrogéis de alginato para Organóides cultura oferece diversas vantagens sobre outros tipos de hidrogéis, tais como as de colágeno incorporando, de fibrina, ou ácido hialurônico. Géis de alginato em temperatura ambiente e pH neutro, que prevê mínimo de interrupção para o tecido como o gel encapsula os 14 organóides. Alginato não reage com as proteínas celulares, proporcionando um suporte quimicamente inerte para o crescimento do tecido 5. O gel pode ser enzimaticamente degradadas utilizando alginato liase, que não degrada o tecido encapsulado, permitindo a recuperação de células em cultura 15. Uma desvantagem do uso de hidrogéis de alginato para tridimensional de cultura de tecidos é que a reticulação iônica fornecendo suporte mecânico para o hidrogel perde estabilidade ao longo do tempo, necessitando de períodos de cultura limitada e re-reticulação do alginato antes da fixação 5. Aspectos críticos deste protocolo estão mantendo a esterilidade durante todo o processo de cultura, bem como dissecção cuidadosa do tecido ovariano e oviductal para evitar perturbações à morfologia dos tecidos.
Do ovário e do oviduto são particularmente adequados para este método porque epitélio ovariano superfície cultivadas em plástico tradicional de cultura de células epiteliais rapidamente sofre a transição mesenquimais, alterações morfológicas e morte celular, a menos que imortalizou, por exemplo, expressão do antígeno SV40 T / t ou hTERT 16, 17. Fraco crescimento da OSE normal em plástico dificulta a análise das potencialmente pré-malignas alterações. O sistema de cultura de órgão também apóia o crescimento do epitélio de superfície do ovário ou epitélio oviductal em contato com as células do estroma subjacente, que pode desempenhar um papel na fisiologia normais e malignas do cells18. Cultura desses tipos de tecido em hidrogéis de alginato fornece suporte mecânico para manter a arquitetura tridimensional do tecido, enquanto que o gel se não interagir com a 5 células.
Usando este método para cultura epitélio de superfície do ovário ou epitélio oviductal permite a análise das alterações moleculares e morfológicas resultantes de manipulações isoladas da cultura. O sistema de hidrogel de alginato permite a passagem livre de transfectadas siRNA, cDNA e shRNA, bem como hormônios e fatores de crescimento 19. Enquanto transfecção transiente não é específico para a OSE, porque este tipo de célula é na superfície externa da eficiência de transfecção organóides superior é alcançado no OSE em comparação com outros tipos de células no interior do ovário, como as células da granulosa. Incorporação de bromodeoxiuridina durante o período de etiquetas cultura células em divisão pelo acompanhamento da evolução do crescimento celular em resposta às condições experimentais. Alterações moleculares no RNA ou nível de proteína pode ser determinada para elucidar mecanismos que levam a alterações neoplásicas.
Enquanto a etiologia precisa de câncer de ovário é desconhecida, um aumento do número de ovulações vida foram mostrados para correlacionar com um risco aumentado para câncer de ovário 20. Análise in vivo das hipóteses que ligam a ovulação para câncer de ovário apresenta muitos desafios em determinar as contribuições das gonadotrofinas, proliferação e inflamação 21-23 carcinogênese. Cultura hidrogel de alginato de ovários e tubas uterinas permite a comparação, isolado direta de cada um desses componentes no epitélio de superfície do ovário e do epitélio oviductal, levando a novas informações sobre a origem do câncer de ovário e sua progressão a partir de células normais para tumores.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Fundo de Pesquisa do Câncer de ovário [conceder LT/UIC/01.2011], o Centro para a Ciência UIC clínica e translacional, do Centro de Câncer UIC, e os Institutos Nacionais de Saúde conceder C06RR15482.
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo AAALAC ao abrigo de protocolos de cuidados animais aprovados pelo Animal Care e do Comitê Use a UIC. Animais para este projeto estão alojados em salas de barreira no Laboratório de Recursos Biológicos (BRL) da Universidade de Illinois em Chicago. O BRL tem uma equipe totalmente veterinária que monitora os animais pelo menos duas vezes por dia e fornece conselhos sobre cuidados com animais.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz L-15 medium | GIBCO, by Life Technologies | 11415 | |
| αMEM medium | GIBCO, by Life Technologies | 12000-022 | |
| Sodium alginate | NovaMatrix | ||
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Polypropylene mesh fiber | McMaster-Carr | 45" wide roll; 0.0041" opening | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668 | |
| Penicillin/streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15070-063 | |
| Alginate lyase | Sigma-Aldrich | A1603 | |
| A1603 | Sigma-Aldrich | C9697 | From Clostridium histolyticum |
| Bovine serum albumin | MP Biomedicals | 103700 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | Gibco | |
| ITS solution | Roche Group | 11074547001 | Insulin/transferrin/sodium selenite |
| Cytokeratin 8 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-1 | Use at 1:200 |
| DAPI | Vector Laboratories | H1200 | |
| Bromodeoxyuridine | Sigma-Aldrich | B50002-1G | Final concentration 10 μM |
References
- Jemal, A.
- Auersperg, N., Woo, M. M., Gilks, C. B. The origin of ovarian carcinomas: a developmental view. Gynecol Oncol. 110, 452-454 (2008).
- Crum, C. P. The distal fallopian tube: a new model for pelvic serous carcinogenesis. Curr Opin Obstet Gynecol. 19, 3-9 (2007).
- Jackson, K. S., Inoue, K., Davis, D. A., Hilliard, T. S., Burdette, J. E. Three-dimensional ovarian organ culture as a tool to study normal ovarian surface epithelial wound repair. Endocrinology. 150, 3921-3926 (2009).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20, 45-53 (1999).
- Augst, A. D., Kong, H. J., Mooney, D. J.
- Amsden, B., Turner, N. Diffusion characteristics of calcium alginate gels. Biotechnol Bioeng. 65, 605-610 (1999).
- Symonds, D. A., Miller, K. P., Tomic, D., Flaws, J. A. Effect of methoxychlor and estradiol on cytochrome p450 enzymes in the mouse ovarian surface epithelium. Toxicol Sci. 89, 510-514 (2006).
- Umezu, T., Hanazono, M., Aizawa, S., Tomooka, Y. Characterization of newly established clonal oviductal cell lines and differential hormonal regulation of gene expression. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39, 146-156 (2003).
- Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring. Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).
- Wilson, R. F., Wiencek, R. G., Balog, M. Predicting and preventing infection after abdominal vascular injuries. J Trauma. 29, 1371-1375 (1989).
- Xu, M. In Vitro Oocyte Maturation and Preantral Follicle Culture from the Luteal Phase Baboon Ovary Produce Mature Oocytes. Biol Reprod. , Forthcoming Forthcoming.
- Xu, M. In vitro grown human ovarian follicles from cancer patients support oocyte growth. Hum Reprod. 24, 2531-2540 (2009).
- Jen, A. C., Wake, M. C., Mikos, A. G. Review: Hydrogels for cell immobilization. Biotechnol Bioeng. 50, 357-364 (1996).
- Iwamoto, Y. Purification and characterization of bifunctional alginate lyase from Alteromonas sp. strain no. 272 and its action on saturated oligomeric substrates. Biosci Biotechnol Biochem. 65, 133-142 (2001).
- Auersperg, N., Maines-Bandiera, S. L., Dyck, H. G., Kruk, P. A. Characterization of cultured human ovarian surface epithelial cells: phenotypic plasticity and premalignant changes. Lab Invest. 71, 510-518 (1994).
- Auersperg, N., Ota, T., Mitchell, G. W. Early events in ovarian epithelial carcinogenesis: progress and problems in experimental approaches. Int J Gynecol Cancer. 12, 691-703 (2002).
- Kruk, P. A., Uitto, V. J., Firth, J. D., Dedhar, S., Auersperg, N. Reciprocal interactions between human ovarian surface epithelial cells and adjacent extracellular matrix. Exp Cell Res. 215, 97-108 (1994).
- West, E. R., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. Physical properties of alginate hydrogels and their effects on in vitro follicle development. Biomaterials. 28, 4439-4448 (2007).
- Auersperg, N., Wong, A. S., Choi, K. C., Kang, S. K., Leung, P. C. Ovarian surface epithelium: biology, endocrinology, and pathology. Endocr Rev. 22, 255-288 (2001).
- Choi, J. H., Wong, A. S., Huang, H. F., Leung, P. C.
- Fathalla, M. F. Incessant ovulation--a factor in ovarian neoplasia. Lancet. 2, 163-163 (1971).
- Espey, L. L. Current status of the hypothesis that mammalian ovulation is comparable to an inflammatory reaction. Biol Reprod. 50, 233-238 (1994).
