Summary
我们的实验室中产生的荧光纳米颗粒用于成像的离子浓度和离子流，在生物系统，如在信令和组织间液的细胞在生理动态平衡。
Abstract
严格监管整个人体的离子平衡是必要的预防脱水等衰弱状态。相比之下，在细胞水平上的快速离子通量发起兴奋细胞动作电位的要求。2钠调节起着重要的作用既这些情况，但是，没有方法，目前存在的连续监测在体内 3和细胞内的钠探头 4没有提供类似的详细结果为钙探针的钠含量。在努力填补这些空洞，荧光纳米传感器已被开发，它可以监控在体外和体内的钠浓度。5,6这些传感器是基于离子选择性optode技术，包括塑在这种特定的识别钠的聚合物颗粒嵌入式元素，pH敏感的荧光，和添加剂。7-9机械，钠识别元素提取到的传感器钠10提取原因的pH敏感的荧光基团释放出氢离子，以保持电中性，这会导致传感器在荧光的变化。钠传感器比钾和钠是可逆的选择性，即使在细胞内浓度高6，他们是直径约120纳米和聚乙二醇涂层传授的生物相容性。 11此外，他们还实时跟踪体内钠浓度的变化时，注入利用显微注射技术，传感器可以传送到他们已被证明是监测时间和空间上跳动的心肌细胞钠动力学细胞的细胞质中。到小鼠皮下3这里，我们详细解释和展示的方法，用于制造荧光钠纳米传感器，并简要展示生物应用，我们的实验室使用的纳米传感器：微量注射到细胞中的传感器和传感器皮下注射入小鼠。
Protocol
1。准备的optode
等分的组件的optode之前，都需要这样，他们可以很容易地测量和存储。
- 一个50毫克的钠离子载体X（NaIX）小瓶和50毫克钠四 - [3,5 - 双（三氟甲基）苯基]硼酸（NaTFPB）将各自提出了在tetrahyrdofuran（THF）和分装到1.5毫升聚苯乙烯离心管。在化学通风柜，溶于四氢呋喃在1毫升50毫克的NaIX航运瓶和组合，以确保完全溶解固体。转移到10个不同的离心管，100μL该解决方案。重复NaTFPB。允许的THF在化学通风柜一夜之间蒸发，标签的离心管，并将其放置在一个存储4度冰箱。这将创建5毫克等分干NaIX和NaTFPB。
- Chromoionophore III（CHIII）溶解于1毫升四氢呋喃，并转移到了3毫升的玻璃小瓶。另1毫升四氢呋喃CHIII航运小瓶解散任何残留CHIII，并加入3毫升玻璃瓶。将有一个目前共有2毫升。将1毫升的四氢呋喃溶液中的CHIII两个单独的1.5毫升，用聚四氟乙烯涂盖的玻璃小瓶。商店在4度的冰箱在终浓度为5毫克/毫升的CHIII的解决方案。
这些分装和解决方案将被用来制造optode材料。
- 移液器66μL之二（2 - 乙基己基）癸二（DOS）到1.5 ml的聚四氟乙烯涂层螺丝帽的玻璃小瓶 - 这是optode小瓶。 DOS是一种粘稠的解决方案，因此必须小心，以确保适量的解决方案，是转移到小瓶。该卷对应〜60毫克的DOS。
- 称取30毫克超高分子量聚（乙烯基）聚氯乙烯（PVC）和转移optode小瓶。
- 现在添加optode小瓶分装功能部件，以创建所需的的optode。 CHIII，NaIX，并NaTFPB的相对浓度，确定传感器的钠的反应。这些浓度可以调整到理想的响应细胞内的浓度，与10毫米，或胞外浓度KD与150毫米KD，有一个传感器。此外，还有可能会被一批批从供应商和校准传感器的化学品的变异性是必要的，以确定是否正确的反应是为每一批新的化学成分发生。在这里，我们描述的方法来创建一个传感器通常用于测量细胞内钠的浓度。
- 在化学通风柜，转移100μL5毫克/毫升CHIII的四氢呋喃溶液optode小瓶。
- 溶解于300μL四氢呋喃NaIX 5毫克和300μL转移到optode小瓶，这关联到5毫克NaIX。
- 溶解于500μL四氢呋喃的5毫克的NaTFPB等分和20μL的溶液转移到optode小瓶，此关联NaTFPB 0.1毫克。
- 加入80μL四氢呋喃optode小瓶。
- optode小瓶溶液中含有30毫克的PVC，DOS的60毫克，5毫克，0.2毫克NaTFPB，CHIII 0.5毫克，500μL四氢呋喃NaIX。直到所有的PVC瓶轻轻涡旋这已经解散。 optode应该是红色。四氢呋喃总额添加到小瓶，不管使用的组件的比例应为500μL。
- 允许NaIX和NaTFPB等分余下的四氢呋喃一夜之间蒸发和重新标签管的化学品的正确。
2。创建的纳米传感器
- 加入100μL10 mg / ml的1,2 - Distearoyl - SN -甘油3 Phosphoethanolamine - N - [甲氧基（聚乙二醇）-550]氯仿（聚乙二醇脂质）到4 DRAM的玻璃小瓶。允许氯仿蒸发在化学通风柜。这个过程可以加快干燥氮气或内部空气的解决方案。
- 添加4毫升的小瓶PEG脂质所需的水溶液。超声提示下面的小瓶放置在实验室插孔和提高小瓶，直到头大约7毫米深的解决方案，低超声功率超声为30秒。在这里，我们使用一个布兰森数字sonifier一个半英寸的尖端直径一步喇叭设置15％的幅度。水溶液可以是任何解决方案。例如，要确定我们trizma基地使用10毫米的HEPES pH值7.2的传感器的响应。
- 虽然解决方案正在超声，50μL与50μL的二氯甲烷在0.6毫升的离心管optode材料混合。用移液管组合，以确保混合均匀。
- 调整sonifier控制超声3分钟。启动超声，而超声添加到溶液中浸泡枪头和分配在一个快速，甚至注射液100μLoptode混合溶液的小瓶。该解决方案应该变成蓝色，depending对水的使用解决方案。
- 允许的超声持续约30秒，然后降低超声提示，使溶液中的约2毫米深的插孔。这应该开始通气的解决方案和解决方案将变得不透明。这一步，有助于消除从溶液中剩余的四氢呋喃和二氯甲烷。
- 超声是完成后，拉起到5毫升注射器的纳米传感器的解决方案。附加的0.2微米注射器的过滤器和分配到一个螺丝顶盖的玻璃小瓶纳米传感器解决方案。该解决方案应该是明确的，蓝色的，如果使用水溶液中包含小于10毫米的钠离子和pH值小于约9。否则，它应该没有颜色，是粉红色的。
3。确定nanonsensor回应
使用此方法来确定的，旨在衡量细胞内钠的纳米传感器的响应。细胞外钠离子浓度的纳米传感器用于不同浓度的建议。
- 10毫米的HEPES（0 NA）和1M氯化钠（氯化钠）在10毫米的HEPES（1米娜）和pH值这些解决方案的每个7.2使用trizma基地解决方案。混合在50毫升锥形离心管娜0娜和1个M的库存解决方案来创建解决方案：0，1，5，10，20，50，100，200，500，1000毫米的NaCl浓度。
- 使用光学底部的96孔板中，以确定响应。添加100μL，每个浓度的钠一列3口井。这将产生一个3 × 10口井的阵列。
- 每孔加100μL新鲜配制的纳米传感器，并加载到微孔板荧光。我们使用一个分子器件Spectramax供应M3的。
- 每孔读以下的波长：
| 激励（NM） | 排放量（纳米） | 切断（NM） |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
在每个波长的纳米传感器强度是依赖于钠离子浓度。使用的波长取决于应用程序。细胞内缓慢的动态测量，我们使用488 nm/570纳米（激发/发射）和488 nm/670 nm，这让我们两个波长的比例和降低噪音。
- 传统上，optode数据被转换为一个值，这是：α=（我- 我分钟）/（I MAX - 我分），我是在一个给定的的钠离子浓度的强度 ，我分是在响应测量的最低强度我最大的是中强度最高的响应测量。转换的强度比在570 nm处，除以在670 nm处的强度或强度在680 nm的α。
- 使用绘图软件，无论是Excel或原产地通常在我们的实验室中使用，情节与钠离子浓度的日志α，钠离子浓度为零的记录设置为-1。一个S形曲线拟合响应。从曲线，计算在α= 0.5的钠离子浓度，代表浓度传感器的最佳响应。
- 调整CHIII，NaIX，并NaTFPB的比例，在optode创建最佳反应，与周围的利益钠离子浓度的纳米传感器。
4。细胞内成像
- 细胞内的测量，纳米传感器在5毫克/毫升的葡萄糖水，进入细胞内注射。
- 细胞生长或转移到玻璃底部盘或玻璃盖玻片底部的成像室。
- 明确的媒体或台氏液培养的细胞。装入到一个epifluorescence显微镜成像室或菜。我们使用的Zeiss LSM的7共聚焦显微镜。
- 毛细玻璃吸管拉马拉。我们使用了1毫米外径，0.78 mm内径玻璃萨特燃烧棕P - 97，到最后尖端直径约300-500纳米。
- 回填与纳米传感器，使用注射器和汉密尔顿针头的解决方案，或者一个微尖器和吸管吸管。
- 吸液管安装到一个是连接到一个显微操纵器和连接到压力控制喷射系统的持有人。在这里，我们使用一个伯利EXFO的PCS 6000显微和医疗系统公司的喷油器。
- 降低的细胞上的吸管，进入细胞质中，有时是必要的“龙头”操盘人捅破了膜。注入的纳米传感器的解决方案，并迅速撤回移液器。
5， 在活体成像
所有程序已经由东北大学的动物护理和使用委员会的审查和批准 。
- 纳米传感器在体内 ，外成像磷酸盐缓冲液，并在135毫米的钠离子浓度调整到最佳响应钠。
- 对于注射的设置和在小鼠体内的荧光纳米传感器的成像，我们使用IVIS Lumina的第二和其关联麻醉单位。消毒的感应和成像商会。放置在感应室CD1的裸鼠（约20克），并使它们为异氟醚。％异氟醚和氧气流量管理上的物种和小鼠的体重会有所不同而有所不同。等待的老鼠变得完全麻醉。
- 小鼠被麻醉后，从诱导室和地方删除成像室的老鼠。保持在麻醉状态下的小鼠。对于每个鼠标，消毒所需的注射区。
- 10μL的纳米传感器，确保删除所有气泡填充31G无菌胰岛素注射器。
- 使用镊子，把握沿所需的注射部位在鼠标背面的一小块皮肤倍。在抓皮肤，插入皮肤注射器朝上的斜面和皮肤针平行。
- 注射传感器之前，拉注射器推杆回，以确保不进针插入血管。然后，轻轻移动针左，右创建一个皮肤内的口袋里。这将最大限度地减少回压，从而导致泄漏注射部位的传感器。注入的传感器，轻轻取下注射器。
- 轻轻施加压力，注射部位，擦干注射部位泄露任何可能的解决方案。这将最大限度地减少不注射到皮肤的传感器的荧光。
- 重复步骤，直到所需的注射区的数量达到5.4至5.7。六注射液均匀地分布在背面的左侧和右侧间隔建议。对于每个单独的鼠标，改变针针插入皮肤变得很困难。 针不应该小鼠之间共享，这将最大限度地减少疾病的传播或在小鼠中的交叉污染。
- 成像的钠荧光传感器，我们获得了使用过滤器设置最紧密匹配的640 nm/680纳米的纳米传感器（激发/发射）频谱，也可以减少皮肤的自体荧光的小鼠明和荧光图像。
6。代表性的成果
图1五种不同的纳米传感器套钠的响应曲线。每套代表从不同optode的配方CHIII，NaTFPB，PVC和DOS相同数额，但NaIX数额不等的纳米传感器。数据被转换为使用680分之639纳米强度的α值。数据是平均3，错误为清晰起见，省略了酒吧，与使用原产一个装有S形曲线。在此响应曲线，使用钠的最高浓度是500毫米。 KD钠钠纳米传感器不等，从10毫米（橙色钻石）到150毫米（黑色方块）。
图2。注入新生的心肌细胞。细胞培养上的玻璃罩，安装在显微镜上，并与钠的纳米传感器注射。显示荧光（639 nm激发），明，和覆盖。请注意，一些传感器集群出现，但细胞形态正常，传感器已经扩散整个细胞质中，并没有核装载。
图3。皮下注射小鼠钠纳米传感器。 9钠纳米传感器的不同注射到裸鼠的皮下空间。明场和荧光图像（六百八十零分之六百四十）重叠。
Discussion
应采取不再形成的纳米传感器已经取得了超过10分钟，一旦optode解决方案和PEG脂质干。 Optode可以不仅在需要时迅速，但在4摄氏度存储时，它们可以几个月的稳定。我们已经表明，nansensors一旦形成，在溶液中稳定，至少一个星期;但是，必须小心，以防止阻止光的纳米传感器，超过这个时间的漂白6虽然钠的纳米传感器在这里进行了论证，已optodes建立生物物种最为相关的离子，如钾和氯化物。10,12，我们还扩大这项技术的小分子如葡萄糖13 。
除了生成的纳米传感器，以监测不同分析物，这些纳米传感器适合其他的变化，这将使他们在大多数生物实验中的有用。例如，表面涂层，在这种情况下，聚乙二醇（PEG），可以很容易地改变使用任何双亲分子，易溶于水。这使functionalizing这些纳米粒子为不同的应用程序或目标的可能性。纳米粒子的大小也可以调整，通过改变表面涂层，超声强度或使用的溶剂。
钙荧光指标已在决定细胞内钙信号的宝贵;然而，没有可用的钠敏感染料具有相同的理想特性。 Optode纳米粒子成像离子细胞在多年的发展，提供了一个替代方法。14，我们已经呼吁建立此以前的研究创建特定的纳米传感器，细胞内的钠成像技术，希望能提供一种手段，了解如何钠信号影响细胞功能和在信号改变，从而导致某些疾病。
在体内的荧光纳米传感器的使用提供一个实时的监测分析物的替代微创超过其他方法 ，如抽血，3钠和葡萄糖纳米传感器基于上述技术已被证明是跟踪钠和葡萄糖的变化，分 别在体内 。3,13然而，目前存在的局限性，这种方法作为一个监测工具。例如，传感器必须包含与对近红外红充分转移，以尽量减少从皮肤背景的自发荧光。15秒频谱荧光团，电流注入技术不产生均匀注射等可能造成的纳米传感器错误注射深度的变化。尽管有这些限制，这些荧光纳米传感器的发展和他们的成功示范，使这些传感器非常宝贵的研究工具和用于监测病人的健康的方法。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
JMD公司和MKB的资助通过IGERT奈米科学和技术方案，在东北大学（资金来自美国国立癌症研究所和美国国家科学基金会资助DGE - 0504331）。这项工作是由美国国立卫生研究院国家普通医学科学格兰特R01 GM084366研究院资助。我们也感谢Saumya Das和安东尼BIDMC罗森茨维格在波士顿为他在动物协议的发展作出贡献的心肌细胞和凯文现金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
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