Summary
Nanoparticules fluorescentes fabriqués dans notre laboratoire sont utilisés pour des concentrations d'ions d'imagerie et de flux d'ions dans les systèmes biologiques tels que les cellules au cours du liquide interstitiel lors de signalisation et de l'homéostasie physiologique.
Abstract
Homéostasie ionique strictement réglementé dans tout le corps est nécessaire pour la prévention de ces états débilitants comme la déshydratation. 1 En revanche, les flux ioniques rapides au niveau cellulaire sont nécessaires pour initier des potentiels d'action dans les cellules excitables. 2 du règlement de sodium joue un rôle important dans les deux ces cas, cependant, il n'existe aucune méthode actuellement de surveiller en permanence les niveaux de sodium in vivo 3 et 4 sondes de sodium intracellulaire ne fournissent pas de semblables résultats détaillés comme sondes calciques. Dans un effort pour combler ces deux lacunes, des nanocapteurs fluorescents ont été développés qui peuvent surveiller les concentrations de sodium in vitro et in vivo. 5,6 Ces capteurs sont basés sur la technologie optode sélective d'ions et se composent de particules de polymère plastifié reconnaissance de sodium dans lequel spécifiques éléments, sensibles au pH fluorophores, et des additifs sont intégrés. 7-9 mécaniste, l'élément de reconnaissance de sodium extraits de sodium dans le capteur 10. Cette extraction entraîne le fluorophore sensible au pH de libérer un ion hydrogène pour maintenir la neutralité de charge dans le capteur qui provoque un changement de fluorescence. Les capteurs de sodium sont réversibles et sélectifs pour le sodium plus de potassium, même à fortes concentrations intracellulaires. 6 Ils sont environ 120 nm de diamètre et sont revêtues de polyéthylène glycol à transmettre biocompatibilité. En utilisant des techniques de micro-injection, les capteurs peuvent être livrés dans le cytoplasme des cellules où elles ont été montrées pour surveiller la dynamique spatiale et temporelle de sodium de battre les myocytes cardiaques. 11 En outre, ils ont également suivi en temps réel l'évolution des concentrations de sodium in vivo lorsqu'elle est injectée sous-cutanée dans des souris 3 de la présente, nous expliquons en détail et de démontrer la méthodologie utilisée pour la fabrication de nanocapteurs fluorescents de sodium et brièvement démontrer les applications biologiques de notre laboratoire utilise les nanocapteurs pour:. la micro-injection des capteurs dans les cellules, et l'injection sous-cutanée des capteurs dans des souris .
Protocol
1. Préparation de optode
Avant de faire l'optode, des aliquotes des composants sont nécessaire afin qu'ils puissent être facilement mesurés et enregistrés.
- A 50 mg de sodium ionophores X (Naix) et une fiole de 50 mg de sodium tétrakis [3,5-bis (trifluorométhyl) phényl] borate (NaTFPB) seront chacun grandi dans tetrahyrdofuran (THF) et répartie dans des tubes de 1,5 ml en polystyrène centrifugeuse. Dans une hotte, dissoudre 50 mg de Naix dans 1 ml de THF dans le flacon d'expédition et mélanger afin de s'assurer que le solide soit complètement dissoute. Transférer 100 ul de cette solution dans 10 tubes à centrifuger séparé. Répétez l'opération pour NaTFPB. Laisser le THF à s'évaporer dans une hotte nuit, l'étiquette des tubes de centrifugation et de les placer dans un réfrigérateur de 4 degrés pour le stockage. Cela crée des aliquotes de 5 mg de sécheresse et de Naix NaTFPB.
- Dissoudre le III Chromoionophore (CHIII) dans 1 ml de THF et le transfert d'un flacon de 3 ml en verre. Ajouter un autre 1 ml de THF dans le flacon d'expédition CHIII de dissoudre toute CHIII résiduelle et l'ajouter à la fiole de verre 3 ml. Il y aura un total de 2 ml maintenant. Transférer 1 ml de la solution de THF CHIII dans deux fioles de verre séparées 1,5 ml avec une bouchons revêtus de Téflon. Conserver la solution dans un réfrigérateur CHIII 4 degrés à la concentration finale de 5 mg / ml.
Ces aliquotes et solutions seront utilisées pour rendre le matériel optode.
- Pipeter 66 ul de bis (2-éthylhexyle) sébaçate (DOS) dans un flacon de 1,5 ml en verre avec un bouchon à vis en Teflon revêtement - c'est le flacon optode. DOS est une solution visqueuse ainsi le soin doit être pris pour assurer la bonne quantité de solution est transféré dans le flacon. Le volume correspond à ~ 60 mg de MS-DOS.
- Peser 30 mg de poly haute masse moléculaire (vinyle) de chlorure (PVC) et transférer les résultats vers le flacon optode.
- Maintenant, ajoutez les composants fonctionnels aliquotés dans le flacon de optode pour créer l'optode désiré. Les concentrations relatives des CHIII, Naix, et NaTFPB va déterminer la réponse du détecteur à sodium. Ces concentrations peuvent être ajustés pour avoir un capteur qui répond idéalement aux concentrations intracellulaires, avec un Kd de 10 mM, ou les concentrations extracellulaires, avec un Kd de 150 mm. En outre, il sera probablement à la variabilité de lot par lot des produits chimiques par le vendeur et l'étalonnage des capteurs est nécessaire pour déterminer si la réponse correcte se produit pour chaque nouveau lot de composants chimiques. Nous décrivons ici la méthode pour créer un capteur avec des concentrations qui sont habituellement utilisés pour les mesures de sodium intracellulaire.
- Dans une hotte, transférer 100 pl de la 5 mg / ml en solution CHIII THF pour le flacon optode.
- Dissolvez 5 mg de Naix dans 300 ul de THF et de transfert 300 pl de la fiole optode, cette corrélation à 5 mg de Naix.
- Dissoudre une aliquote de 5 mg de l'NaTFPB dans 500 ul de THF et de transfert de 20 ul de la solution dans le flacon de optode, cette corrélation à 0,1 mg de NaTFPB.
- Ajouter 80 ul de THF dans le flacon de optode.
- La solution dans le flacon optode contient 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de Naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII dans 500 ul de THF. Vortexer doucement ce flacon jusqu'à ce que tous le PVC a dissous. L'optode doit être d'une couleur rouge. Le montant total de THF ajouté au flacon doit être de 500 uL quel que soit le rapport des composants utilisés.
- Laisser le THF restant dans le Naix et des aliquots NaTFPB de s'évaporer durant la nuit et ré-étiqueter le tube avec la quantité correcte de produit chimique.
2. Créer nanocapteurs
- Pipeter 100 ul de 10 mg / ml de 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine-N - [méthoxy (polyéthylèneglycol) -550] dans le chloroforme (PEG-lipides) dans un flacon de 4 drams verre. Autoriser le chloroforme à s'évaporer dans une hotte. Ce processus peut être accéléré par le séchage de la solution avec de l'azote ou air de la maison.
- Ajouter 4 ml de la solution aqueuse désirée dans le flacon avec PEG-lipides. Placez le flacon sur une prise de laboratoire au-dessous de la pointe sonication et augmenter le flacon jusqu'à la pointe est d'environ 7 mm de profondeur dans la solution et soniquer à une puissance faible sonication pendant 30 secondes. Ici, nous utilisons une Branson numériques sonificateur mis à l'amplitude de 15% avec une pointe de ½ pouce de diamètre étape de corne. La solution aqueuse peut être une solution. Par exemple, pour déterminer la réponse des capteurs que nous utilisons l'HEPES 10 mM pH 7,2 avec une base Trizma.
- Alors que la solution est soniqué, mélanger 50 ul du matériel optode avec 50 ul de dichlorométhane dans un tube à centrifuger de 0,6 ml. Mélanger avec la pipette pour assurer un mélange uniforme.
- Réglez la commande sonificateur à une sonication pendant 3 minutes. Démarrez le sonication et tout sonication ajouter la solution de mélange optode dans le flacon en plongeant la pointe de la pipette dans la solution et de distribuer les 100 ul de solution dans un rapide, même l'injection. La solution doit virer au bleu, depending sur la solution aqueuse utilisée.
- Autoriser la sonication se poursuivre pendant environ 30 secondes, puis baisser le cric pour que la pointe sonication est d'environ 2 mm de profondeur dans la solution. Cela devrait commencer à aérer la solution et la solution devient opaque. Cette étape permet d'enlever le THF résiduel et de la solution de dichlorométhane.
- Une fois la sonication est terminée, tirez sur la solution de nanocapteurs dans une seringue de 5 ml. Fixer un filtre de 0,2 um seringue et passer la solution nanocapteur dans un flacon en verre avec bouchon à vis. La solution doit être limpide et bleu si une solution aqueuse qui contient moins de 10 mM de sodium et a un pH inférieur à environ 9 est utilisé. Sinon, il ne devrait pas avoir de couleur ou d'être rose.
3. Déterminer la réponse nanonsensor
Cette méthode est utilisée pour déterminer la réponse de nanocapteurs conçu pour mesurer sodium intracellulaire. Différentes concentrations sont recommandés pour être utilisés pour extracellulaire nanocapteurs concentration en sodium.
- Faire des solutions stock de 10 mM HEPES (0 Na) et de chlorure de sodium 1M (NaCl) dans 10 mM HEPES (1 M Na) et le pH de chacune de ces solutions à 7,2 en utilisant la base Trizma. Mélanger les solutions stock de 0 et 1 M Na Na dans 50 ml tubes à centrifuger coniques pour créer des solutions avec: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mm concentrations de NaCl.
- Utilisez un fond optique plaque de 96 puits pour déterminer la réponse. Ajouter 100 ul de chaque concentration de sodium dans 3 puits d'une colonne. Ceci va produire un tableau de 3 x 10 puits.
- Pour chaque puits ajouter 100 ul de nanocapteurs fraîchement préparés et la charger dans un fluorimètre microplaque. Nous utilisons une Molecular Devices Spectramax M3.
- Lisez chaque bien avec les longueurs d'onde suivantes:
| Excitation (nm) | Emission (nm) | Cut-Off (nm) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
L'intensité de nanocapteurs à chaque longueur d'onde dépend de la concentration en sodium. L'utilisation de la longueur d'onde dépend des applications. Pour intracellulaire des mesures dynamiques lentes, nous utilisons 488 nm/570 nm (excitation / émission) et 488 nm/670 nm qui nous permettent de ratio de deux longueurs d'onde et de réduire le bruit.
- Traditionnellement, optode données sont converties en une des valeurs qui sont: α = (I - I min) / (I max - I min), où I est l'intensité à une concentration de sodium donné, je min est la plus faible intensité dans les mesures de réponse , et I max est la plus grande intensité dans les mesures de réponse. Convertir soit le ratio d'intensité à 570 nm divisée par l'intensité à 670 nm ou de l'intensité à 680 nm à α.
- Utilisez un logiciel de traçage, Excel ou Origin sont généralement utilisés dans notre laboratoire, pour tracer α en fonction du log de la concentration de sodium, la mise dans le journal de la concentration de sodium de zéro à -1. Ajuster une courbe sigmoïde à la réponse. D'après la courbe, calculer la concentration de sodium à α = 0,5, qui représente la concentration à laquelle le capteur répond de façon optimale.
- Ajustez le taux d'CHIII, Naix, et NaTFPB dans le optode de créer nanocapteurs avec une réponse optimale autour de la concentration en sodium de l'intérêt.
4. Imagerie intracellulaire
- Pour des mesures intracellulaire, les nanocapteurs sont faites en 5 mg / ml de glucose dans l'eau et micro-injectées dans les cellules.
- Croître ou le transfert de cellules dans un plat à fond de verre ou dans une chambre d'imagerie avec un fond lamelle de verre.
- Incuber les cellules dans les médias claire ou une solution de Tyrode. Montez la chambre de l'imagerie ou un plat sur un microscope à épifluorescence. Nous utilisons un Zeiss LSM 7 microscope confocal.
- Tirez capillaire en verre avec un extracteur de pipette. Nous utilisons une Sutter flamboyante brune p-97 avec 1 mm de diamètre extérieur, 0,78 mm ID de verre, d'un diamètre de l'extrémité finale autour 300-500 nm.
- Remblai de la pipette avec la solution de nanocapteurs utilisant une seringue et une aiguille Hamilton, ou un chargeur de micropointes et une pipette.
- Montez la pipette dans un support qui est attaché à un micromanipulateur et relié à un système d'injection à pression contrôlée. Ici, nous utilisons un micromanipulateur Burleigh EXFO 6000 PCS et une société médicale des systèmes d'injection.
- Basse de la pipette sur le dessus de la cellule et dans le cytoplasme, il est parfois nécessaire de "taper" le titulaire manipulateur pour percer la membrane. Injecter la solution nanocapteurs et retirer rapidement la pipette.
5. Imagerie in vivo
Toutes les procédures ont été examinés et approuvés par Animal Care Northeastern University et le Comité d'utilisation.
- Nanocapteurspour les in vivo, imagerie extracellulaire sont faites dans du tampon phosphate salin et ajusté pour avoir une réponse optimale à sodium à une concentration de sodium de 135 mm.
- Pour l'injection d'installation et d'imagerie de l'nanocapteurs fluorescents chez la souris, nous utilisons le IVIS Lumina II et son unité d'anesthésie sont associés. Désinfecter l'induction et chambres d'imagerie. Placez la souris nude CD1 (environ 20g) dans la chambre de l'induction et les exposent à l'isoflurane. Le pour cent du débit d'oxygène administré isoflurane et varient selon l'espèce et le poids des souris. Attendez la souris pour devenir pleinement anesthésiés.
- Après les souris sont anesthésiées, retirer les souris de la chambre de l'induction et le placer dans la chambre de l'imagerie. Gardez la souris sous anesthésie. Pour chaque souris, désinfecter les zones d'injection désiré.
- Remplir une seringue d'insuline stériles 31G avec 10 uL de nanocapteurs en veillant à éliminer toutes les bulles d'air.
- En utilisant une pince, saisir un petit pli de la peau le long du dos de la souris sur le site d'injection désiré. Tout en saisissant la peau, insérer la seringue dans la peau avec le biseau vers le haut et le parallèle l'aiguille à la peau.
- Avant d'injecter les capteurs, tirez sur le piston de la seringue pour s'assurer que l'aiguille n'est pas insérée dans un vaisseau sanguin. Puis, déplacez doucement le droit d'aiguilles et de gauche pour créer une poche dans la peau. Cela permettrait de minimiser la contre-pression qui provoque les capteurs de s'échapper du site d'injection. Injecter des capteurs et retirez délicatement la seringue.
- Appuyez doucement sur le site d'injection et essuyez toute solution qui peut avoir fui hors du site d'injection. Cela permettrait de minimiser la fluorescence de capteurs qui ne sont pas injectés dans la peau.
- Répétez les étapes 5.4 à 5.7 jusqu'à ce que le nombre de zones d'injection souhaitée est atteinte. Six sites d'injection espacés sur le côté gauche et à droite de l'arrière sont recommandés. Pour chaque souris individuelle, le changement d'aiguilles, si l'aiguille devient difficile d'insérer dans la peau. Aiguilles ne doivent pas être partagés entre les souris. Cela permettrait de minimiser la transmission de maladies ou de contamination croisée entre les souris.
- Pour les capteurs d'imagerie fluorescente de sodium, on acquiert à la fois clair et des images fluorescentes de la souris en utilisant des jeux de filtres que la plupart correspondait étroitement à la nm/680 640 nm (excitation / émission) spectre de la nanocapteurs et que aussi minimiser l'autofluorescence de la peau.
6. Les résultats représentatifs
Figure 1. Courbes de réponse de cinq différents ensembles nanocapteur au sodium. Chaque ensemble représente nanocapteurs à partir des formulations différentes optode qui avait la même quantité de CHIII, NaTFPB, PVC et DOS, mais des quantités variables de Naix. Les données ont été converties en valeurs α en utilisant les intensités 639/680 nm. Les données sont une moyenne de 3 barres d'erreur, omis pour la clarté, avec une courbe sigmoïde équipé utilisant origine. Dans cette courbe de réponse, la concentration maximale de sodium utilisé était de 500 mM. Le Kd de l'nanocapteurs de sodium de sodium varie de 10 mM (diamants orange) à environ 150 mm (carrés noirs).
Figure 2. Injecté myocytes cardiaques néonatales. Les cellules ont été cultivées sur lamelle, monté sur un microscope et injectée avec nanocapteurs de sodium. Illustré sont fluorescents (excitation 639 nm), clair, et la superposition. Notez que certains de clustering sonde se produit, mais les cellules ont une morphologie normale, les capteurs ont diffusé dans le cytosol et il n'ya pas de chargement nucléaire.
Figure 3. Injection sous-cutanée de souris avec nanocapteurs de sodium. Neuf injections différentes de nanocapteurs de sodium ont été faites dans l'espace sous-cutanée de souris nude. Les deux champs lumineux et images fluorescentes (640/680) sont superposées.
Discussion
La formation de nanocapteurs devraient pas prendre plus de 10 minutes une fois la solution optode a été faite et le lipide PEG séché. Optode ne peut pas seulement être prises rapidement en cas de besoin, mais lorsqu'il est conservé à 4 degrés Celsius, ils peuvent être stables pendant des mois. Nous avons montré que l'nansensors, une fois formés, sont stables en solution pendant au moins une semaine;. Cependant, des précautions doivent être prises pour empêcher photoblanchiment cours de cette période en bloquant les nanocapteurs de la lumière 6 Bien nanocapteurs de sodium ont été démontré ici, optodes ont été créés pour la plupart des ions biologiquement pertinents tels que le potassium et le chlorure. 10,12 Nous avons également étendu cette technologie à de petites molécules comme le glucose. 13
En plus de générer nanocapteurs pour surveiller différents analytes, ces nanocapteurs se prêtent à d'autres changements qui les rendent utiles dans la plupart des expériences biologiques. Par exemple, le revêtement de surface, dans ce cas, le poly (éthylène glycol), peut facilement être changé en utilisant toute molécule amphiphile qui est soluble dans l'eau. Cela permet la possibilité de fonctionnalisation de ces nanoparticules pour des applications différentes ou des cibles. La taille des nanoparticules peut également être ajustée en changeant le revêtement de surface, l'intensité sonication ou le solvant utilisé.
Indicateurs de calcium fluorescents ont été précieux dans la détermination de la signalisation intracellulaire de calcium, mais pas de colorants de sodium disponibles sensibles ont les mêmes caractéristiques idéales. Optode nanoparticules pour but de fournir une méthode alternative pour les ions d'imagerie intracellulaire ont été en développement pendant des années 14. Nous avons construit sur cette recherche précédentes pour créer nanocapteurs spécifiques pour l'imagerie de sodium intracellulaire qui devrait permettre de fournir un moyen de comprendre comment la signalisation de sodium affecte la fonction cellulaire et altérations de la signalisation qui conduisent à certaines maladies.
L'utilisation de nanocapteurs fluorescents in vivo en temps réel offre une-alternative minimalement invasive pour les analytes de surveillance sur les autres méthodes telles que le sang attire 3. Sodium et de glucose nanocapteurs basé sur la technologie ci-dessus a été démontré que de suivre l'évolution de sodium et de glucose, respectivement en vivo. 3,13 Toutefois, il existe actuellement des limites à cette méthode comme un outil de surveillance. Par exemple, les capteurs doivent contenir un fluorophore avec un éventail suffisamment décalée vers le rouge proche infrarouge afin de minimiser l'autofluorescence de fond de la peau. 15 Deuxièmement, la technique d'injection de courant ne produit pas d'injection uniforme des nanocapteurs qui pourraient être causés par de telles erreurs que les variations de la profondeur d'injection. Malgré ces limites, le développement de ces nanocapteurs fluorescents et leur démonstration réussie pourrait rendre ces capteurs un outil de recherche inestimable et méthode de surveillance de la santé des patients.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
JMD et MKB sont financés par la science nanomédecine IGERT et technologie à la Northeastern University (financement du NCI et NSF Grant DGE-0504331). Ce travail a également été financée par les Instituts nationaux de la santé de l'Institut national des sciences médicales générales R01 Grant GM084366. Nous remercions également Saumya Das et Anthony Rosenzweig du BIDMC à Boston pour fournir des myocytes cardiaques et Kevin Cash pour sa contribution à l'élaboration du protocole d'origine animale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
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