Summary
Nanopartículas fluorescentes producidos en nuestro laboratorio se utilizan para las concentraciones de iones de imágenes y los flujos de iones en los sistemas biológicos, como las células en el líquido intersticial y la señalización en la homeostasis fisiológica.
Abstract
Homeostasis de iones fuertemente regulado por todo el cuerpo es necesario para la prevención de tales estados debilitantes como la deshidratación. 1 Por el contrario, los flujos rápidos de iones a nivel celular son necesarios para iniciar los potenciales de acción en las células excitables. 2 Reglamento de sodio juega un papel importante en los dos estos casos, sin embargo, ningún método actualmente existe para un seguimiento continuo de los niveles de sodio en vivo 3 y sondas intracelulares de sodio al 4 no ofrecen similares resultados detallados de las sondas de calcio. En un esfuerzo para llenar las dos de estos vacíos, nanosensores fluorescentes se han desarrollado que puede monitorear las concentraciones de sodio in vitro e in vivo. 5,6 Estos sensores se basan en la tecnología optode selectivo de iones y se componen de partículas de polímero plastificado en el que el reconocimiento específico de sodio elementos, fluoróforos sensible al pH, y los aditivos son incorporados. 9.7 Mecánica, el elemento de reconocimiento de sodio de extractos de sodio en el sensor. 10 Esta extracción provoca que el fluoróforo sensible al pH de liberar un ion de hidrógeno para mantener la neutralidad de la carga en el sensor que hace que un cambio en la fluorescencia. Los sensores de sodio es reversible y selectivo de sodio más potasio, incluso a altas concentraciones intracelulares. 6 Son aproximadamente 120 nm de diámetro y están revestidos con polietileno glicol para impartir la biocompatibilidad. Utilizando técnicas de microinyección, los sensores pueden ser entregados en el citoplasma de las células donde se ha demostrado para monitorear la dinámica temporal y espacial de sodio de vencer a los miocitos cardíacos. 11 Por otra parte, también han seguido en tiempo real los cambios en las concentraciones de sodio en vivo cuando se inyecta por vía subcutánea en ratones de 3 En este documento, se explica en detalle y demostrar la metodología para la fabricación de nanosensores fluorescentes de sodio y una breve demostrar las aplicaciones biológicas de nuestro laboratorio utiliza los nanosensores para:. la microinyección de los sensores en las células, y la inyección subcutánea de los sensores en los ratones .
Protocol
1. Preparación de optode
Antes de tomar la optode, alícuotas de los componentes se necesitan para que puedan ser fácilmente medidos y guardados.
- A 50 mg de sodio ionóforo X (Naix) y un vial de 50 mg de sodio tetrakis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) cada uno será educado en tetrahyrdofuran (THF) y alícuotas en tubos de 1,5 ml de centrífuga de poliestireno. En una cabina de humos química, se disuelven 50 mg de Naix en 1 ml de THF en el vial de transporte y mezcla para asegurarse de que el sólido se haya disuelto completamente. Transferencia de 100 l de esta solución en 10 tubos de centrifugación por separado. Repita el procedimiento para NaTFPB. Deje que el THF se evapore en una campana para vapores químicos durante la noche, la etiqueta de los tubos de centrífuga y colocarlos en el refrigerador de 4 grados para el almacenamiento. Esto crea alícuotas de 5 mg de materia seca y Naix NaTFPB.
- Disolver el III Chromoionophore (CHIII) en 1 ml de THF y transferir a un vial de 3 ml de vidrio. Añadir otra 1 ml de THF en el vial de envío CHIII para disolver cualquier CHIII residual y añadir esto a la ampolla de vidrio de 3 ml. Habrá un total de 2 ml ahora. Transferir 1 ml de la solución de THF en CHIII a dos viales separados 1,5 ml de vidrio con tapas de teflón. Guarde la solución CHIII en un refrigerador de 4 grados en la concentración final de 5 mg / ml.
Estas alícuotas de las soluciones y se utilizará para hacer el material optode.
- Pipeta de 66 l de bis (2-etilhexil) sebacato (DOS) en un vial de 1,5 ml de vidrio con tapón de rosca de teflón - este es el vial optode. DOS es una solución viscosa que se debe tener cuidado para asegurar la cantidad adecuada de solución se transfiere al vial. El volumen corresponde a ~ 60 mg de DOS.
- Pesar 30 mg de alto peso molecular de poli (vinilo) (PVC) y la transferencia de esta a la optode vial.
- Ahora agregue los componentes funcionales de alícuotas para el vial optode para crear el optode deseado. Las concentraciones relativas de CHIII, Naix, y NaTFPB determinará la respuesta del sensor con el sodio. Estas concentraciones se pueden ajustar para tener un sensor que, idealmente, responde a las concentraciones intracelulares, con una Kd de 10 mm, o las concentraciones extracelulares, con una Kd de 150 mM. Además, es probable que haya lotes a la variabilidad del lote de los productos químicos del proveedor y la calibración de los sensores es necesario determinar si la respuesta correcta es que ocurren para cada nuevo lote de componentes químicos. A continuación se describe el método para crear un sensor con las concentraciones que se suelen utilizar para las mediciones de sodio intracelular.
- En una cabina de humos química, la transferencia de 100 l de los 5 mg / ml CHIII en solución de THF en el vial optode.
- Disuélvanse 5 mg de Naix en 300 l de THF y la transferencia de 300 l en el vial optode, esto se correlaciona con 5 mg de Naix.
- Disolver una alícuota de 5 mg de la NaTFPB en 500 l de THF y la transferencia de 20 l de la solución en el vial optode, esto se correlaciona con 0,1 mg de NaTFPB.
- Añadir 80 l de THF en el vial optode.
- La solución en el vial optode contiene 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de Naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII en 500 l de THF. Suavemente vórtice de este vial hasta que todo el PVC se ha disuelto. El optode debe ser de un color rojo. La cantidad total de THF añadido al vial debería ser de 500 l, independientemente de la relación de los componentes utilizados.
- Deje que el resto de THF en el Naix y alícuotas NaTFPB que se evapore toda la noche y volver a la etiqueta del tubo con la cantidad correcta de productos químicos.
2. La creación de nanosensores
- Pipetear 100 L de 10 mg / ml de 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N - [metoxi (polietilenglicol) -550] en cloroformo (PEG-lípido) en un vial de 4 copitas de cristal. Deje que el cloroformo se evapore en una cabina de humos química. Este proceso puede ser acelerado por secado de la solución con nitrógeno gaseoso o aire casa.
- Agregar 4 ml de la solución acuosa deseada en el vial con el PEG-lípido. Coloque el vial sobre una toma de laboratorio por debajo de la punta de ultrasonidos y elevar el vial hasta que la punta es de unos 7 mm de profundidad en la solución y ultrasonidos a una potencia de ultrasonidos de baja durante 30 segundos. Aquí se utiliza una Branson digitales Sonifier establece en 15% de la amplitud con un cuerno de ½ pulgada de paso de diámetro de la punta. La solución acuosa puede ser cualquier solución. Por ejemplo, para determinar la respuesta de los sensores que utilizan 10 mM HEPES pH 7,2 con base trizma.
- Mientras que la solución se sonica, mezcla de 50 l de material optode con 50 l de diclorometano en un tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Mezclar con la pipeta para asegurar una mezcla.
- Ajuste el control de Sonifier de ultrasonidos durante 3 minutos. Iniciar el tratamiento con ultrasonidos y ultrasonidos, mientras que añadir la solución de la mezcla optode al vial mediante la inmersión de la punta de la pipeta en la solución y la dispensación de la l 100 de la solución en un rápido, incluso la inyección. La solución debe ponerse azul, depending en la solución acuosa utilizada.
- Deje que el tratamiento con ultrasonidos para continuar durante unos 30 segundos y luego baje el gato de modo que la punta de ultrasonidos es de aproximadamente 2 mm de profundidad en la solución. Esto debe comenzar a airear la solución y la solución se volverá opaco. Este paso ayuda a eliminar el THF residual y diclorometano de la solución.
- Una vez se haya completado la sonicación, tire hacia arriba la solución nanosensor en una jeringa de 5 ml. Coloque un filtro de 0,2 micras jeringuilla y vierta la solución nanosensor en un frasco de vidrio con tapa de rosca. La solución debe ser transparente y azul si es una solución acuosa que contiene menos de 10 mM de sodio y tiene un pH menor de 9 se utiliza. De lo contrario, no debe tener color o ser de color rosa.
3. Determinación de la respuesta nanonsensor
Este método se utiliza para determinar la respuesta de nanosensores diseñado para medir el sodio intracelular. Diferentes concentraciones se recomienda el uso de nanosensores para la concentración de sodio extracelular.
- Que las soluciones stock de 10 mM HEPES (0 Na) y cloruro de sodio 1M (NaCl) en 10 mM HEPES (1 M Na) y el pH de cada una de estas soluciones a 7,2 usando la base trizma. Mezcle las soluciones madre de 0 y 1 Na Na M en tubos de 50 ml cónicos de centrífuga para crear soluciones con: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 concentraciones mM de NaCl.
- Use un fondo óptico placa de 96 pozos para determinar la respuesta. Añadir 100 ml de cada concentración de sodio al 3 pozos en una columna. Esto producirá una serie de 3 x 10 pozos.
- A cada pocillo se añaden 100 l de nanosensores recién preparados y de carga en un fluorómetro de microplacas. Utilizamos un molecular Spectramax dispositivos M3.
- Lea cada una y con las longitudes de onda siguientes:
| Excitación (nm) | Emisión (nm) | Cut-Off (nm) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
La intensidad de nanosensor en cada longitud de onda depende de la concentración de sodio. El uso de la longitud de onda depende de las aplicaciones. Para las mediciones intracelulares dinámica lenta, utilizamos 488 nm/570 nm (excitación / emisión) y 488 nm/670 nm, que nos permiten la relación entre dos longitudes de onda y reducir el ruido.
- Tradicionalmente, optode de datos se convierte en un valor que son: α = (I - I min) / (I max - min I), donde I es la intensidad en una concentración de sodio dado, min es el menor intensidad en las medidas de respuesta , y el máximo es de mayor intensidad en las medidas de respuesta. Convierta que la proporción de intensidad a 570 nm dividida por la intensidad a 670 nm o la intensidad a 680 nm a α.
- Utilice el software de trazado, ya sea Excel o de origen se utilizan normalmente en nuestro laboratorio, para trazar α versus el logaritmo de la concentración de sodio, estableciendo el registro de la concentración de sodio de cero a -1. Ajustar una curva sigmoidal a la respuesta. Partir de la curva, calcular la concentración de sodio en α = 0,5, que representa la concentración en la que el sensor responde de manera óptima.
- Ajustar la relación de CHIII, Naix, y NaTFPB en el optode para crear nanosensores con una respuesta óptima en torno a la concentración de sodio de interés.
4. Imágenes intracelulares
- Para las mediciones intracelulares, los nanosensores se hacen en 5 mg / ml de glucosa en agua y microinyección en las células.
- Crecer o transferir las células en un plato con fondo de cristal o una cámara de imágenes con un fondo cubreobjetos.
- Se incuban las células en los medios de comunicación clara o una solución de Tyrode. Monte la cámara de imágenes o un plato en un microscopio de epifluorescencia. Utilizamos un Zeiss LSM 7 microscopio confocal.
- Tire capilar de vidrio con un extractor de la pipeta. Nosotros usamos un flamante café Sutter P-97 con 1 mm de diámetro exterior, de vidrio 0,78 mm de diámetro, con un diámetro de la punta final de alrededor de 300-500 nm.
- Rellene la pipeta con la solución de nanosensor con una jeringa y una aguja de Hamilton, o un cargador de micropunta y una pipeta.
- Montaje de la pipeta en un soporte que se adjunta a un micromanipulador y conectado a un sistema de presión de inyección controlada. Aquí se utiliza un micromanipulador Burleigh EXFO 6000 PCS y sistemas médicos de empresa de inyección.
- Inferior de la pipeta en la parte superior de la celda y en el citoplasma, a veces es necesario "tocar" el titular de manipulador de perforar la membrana. Se inyecta la solución nanosensor y rápidamente retirar la pipeta.
5. En vivo imágenes
Todos los procedimientos han sido revisados y aprobados por el Cuidado de Animales de la Universidad Northeastern y el empleo.
- Nanosensoresen vivo, imágenes extracelular se realizan en tampón fosfato salino y ajustado para tener una respuesta óptima al sodio a una concentración de sodio de 135 mm.
- Para la inyección de configuración y la imagen de los nanosensores fluorescente en ratones, se utiliza el IVIS Lumina II y su unidad de anestesia asociado. Desinfectar la inducción y las cámaras de imagen. Lugar CD1 ratones desnudos (aproximadamente 20 g) en la cámara de inducción y los exponen a isoflurano. El porcentaje de caudal isoflurano y oxígeno administrada variará dependiendo de la especie y el peso de los ratones. Espere a que los ratones para convertirse en totalmente anestesiado.
- Después de los ratones anestesiados, eliminar a los ratones de la cámara de inducción y el lugar en la cámara de imágenes. Mantener a los ratones con anestesia. Para cada ratón, desinfectar las áreas de inyección deseada.
- Llene una jeringa de insulina 31G con 10 l de nanosensores y asegúrese de eliminar todas las burbujas de aire.
- Con unas pinzas, agarre un pequeño pliegue de la piel a lo largo de la parte posterior del ratón en el sitio de la inyección deseado. Mientras sujeta la piel, insertar la aguja en la piel con el bisel hacia arriba y la aguja paralela a la piel.
- Antes de la inyección de los sensores, tire hacia atrás el émbolo de la jeringa para asegurarse de que la aguja no se inserta en un vaso sanguíneo. Luego, mueva suavemente la aguja derecha y la izquierda para crear una bolsa dentro de la piel. Esto reducirá al mínimo la presión trasera que hace que los sensores se escape de la zona de inyección. Inyectar los sensores y retire con cuidado la jeringa.
- Para aplicar una suave presión en el sitio de inyección y limpie cualquier solución que puede haber escapado del lugar de la inyección. Esto minimizará la fluorescencia de los sensores que no se inyectan en la piel.
- Repita los pasos 5.4 a 5.7 hasta que el número de áreas de inyección deseada. Seis puntos de inyección uniformemente espaciados en el lado izquierdo y derecho de la espalda se recomienda. Para cada ratón individual, cambiar las agujas, si la aguja se vuelve difícil de insertar en la piel. Las agujas no deben ser compartidos entre los ratones. Esto reducirá al mínimo la transmisión de enfermedades o la contaminación cruzada entre los ratones.
- Para obtener imágenes de los sensores de sodio fluorescente, adquirimos dos imágenes campo claro y fluorescencia de los ratones con los conjuntos de filtros que se acercaba más a los 640 nm/680 nm (excitación / emisión) del espectro de los nanosensores y que también minimizan la autofluorescencia de la piel.
6. Resultados representante
Figura 1. Curvas de respuesta de cinco grupos diferentes nanosensor de sodio. Cada juego representa nanosensores a partir de formulaciones diferentes optode que había la misma cantidad de CHIII, NaTFPB, PVC y DOS, pero diferentes cantidades de Naix. Los datos se convierten en valores de α con la intensidad de 639/680 nm. Los datos son un promedio de 3 barras de error, omitidas por claridad, con una curva sigmoidal equipado con Origen. En esta curva de respuesta, la concentración máxima de sodio utilizado fue de 500 mM. La Kd de los nanosensores de sodio de sodio fue de 10 mM (los diamantes de color naranja) a unos 150 mm (cuadrados de color negro).
Figura 2. Inyectado neonatal miocitos cardíacos. Las células fueron cultivadas en cubreobjetos, montada en un microscopio y se inyecta con nanosensores de sodio. Se muestran los fluorescentes (nm de excitación 639), claro, y la superposición. Tenga en cuenta que un agrupamiento de sensores se produce, pero las células tienen una morfología normal, los sensores se han difundido en todo el citosol y no hay ninguna carga nuclear.
Figura 3. Inyección subcutánea en ratones con nanosensores de sodio. Nueve inyecciones distintas de nanosensores de sodio se realizaron en el espacio subcutáneo de ratones desnudos. Tanto en campo claro y las imágenes fluorescentes (640/680) se superponen.
Discussion
La formación de nanosensores no debe tardar más de 10 minutos una vez que la solución optode se ha hecho y se secan los lípidos PEG. Optode no sólo se pueden hacer rápidamente cuando sea necesario, pero cuando se almacenan a 4 grados centígrados, pueden ser estables durante meses. Hemos demostrado que la nansensors, una vez formados, son estables en solución por lo menos durante una semana;. Sin embargo, se debe tener cuidado para evitar que photobleaching durante este tiempo mediante el bloqueo de los nanosensores de la luz 6 Mientras nanosensores de sodio se ha demostrado aquí, optodes han sido creado para la mayoría de los iones biológicamente relevantes, tales como el potasio y cloruro. 10,12 También se ha extendido esta tecnología a pequeñas moléculas como la glucosa 13.
Además de generar nanosensores para controlar diferentes analitos, estos nanosensores son susceptibles de otros cambios que los hacen útiles en la mayoría de los experimentos biológicos. Por ejemplo, el revestimiento de la superficie, en este caso poli (etilenglicol), se puede cambiar fácilmente con cualquier molécula anfifílica que es soluble en agua. Esto permite la posibilidad de funcionalización estas nanopartículas para diferentes aplicaciones o destinos. El tamaño de las nanopartículas también se puede ajustar mediante la alteración de la capa superficial, la intensidad de ultrasonidos o utilizar el disolvente.
Indicadores fluorescentes de calcio han sido muy valiosa para determinar la señalización del calcio intracelular, sin embargo, sin tintes sensibles al sodio disponibles tienen las características ideales mismo. Optode nanopartículas destinadas a proporcionar un método alternativo para la imagen de los iones intracelulares han estado en desarrollo desde hace años. 14 Hemos construido sobre esta investigación previa para crear nanosensores específicos para obtener imágenes de sodio intracelular que se espera ofrecer un medio para comprender cómo la señalización de sodio afecta la función celular y alteraciones en la señalización que conducen a ciertas enfermedades.
El uso de nanosensores fluorescentes en vivo ofrece un tiempo de real alternativa mínimamente invasiva para los analitos de vigilancia respecto a otros métodos, tales como extracciones de sangre. 3 de sodio y glucosa nanosensores basados en la tecnología anterior se ha demostrado que seguir los cambios en el sodio y glucosa, respectivamente, en vivo. 3,13 Sin embargo, actualmente existen limitaciones a este método como una herramienta de monitoreo. Por ejemplo, los sensores deben contener un fluoróforo con un espectro lo suficientemente desplazado hacia el rojo del infrarrojo cercano con el fin de minimizar la autofluorescencia de fondo de la piel. 15 En segundo lugar, la técnica de inyección de corriente no produce la inyección uniforme de los nanosensores que puedan ser causados por tales errores como la variación en la profundidad de la inyección. A pesar de estas limitaciones, el desarrollo de estos nanosensores fluorescentes y su demostración con éxito podría hacer que estos sensores una invaluable herramienta de investigación y método para monitorear la salud del paciente.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
JMD y MKB se financian a través de la ciencia Nanomedicina IGERT y el programa de Tecnología en la Universidad Northeastern (fondos de NCI y NSF subvención DGE-0504331). Este trabajo también fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales Grant R01 GM084366. También agradecemos a Saumya Das y Anthony Rosenzweig de BIDMC en Boston para proporcionar los miocitos cardíacos y Kevin Cash, por su contribución en el desarrollo del protocolo de los animales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
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