Lysrör Nanopartiklar för mätning av jonkoncentration i biologiska system

Summary

Fluorescerande nanopartiklar som produceras i vårt labb används för avbildning jon koncentrationer och flöden jon i biologiska system, såsom celler under signalering och interstitiell vätska under fysiologiska homeostas.

Abstract

Hårt reglerad jon homeostas i hela kroppen är nödvändigt för förebyggande av sådana försvagande stater som uttorkning. ¹ Däremot är snabba jon flöden på cellulär nivå som krävs för att initiera aktionspotentialer i retbara celler. ² Natrium reglering spelar en viktig roll i båda dessa fall, men det finns ingen metod idag för kontinuerlig övervakning av natrium nivåerna in ^vivo-3 och intracellulär prober natrium ⁴ ger inte lika detaljerade resultat som kalcium sonder. I ett försök att fylla båda dessa tomrum har fluorescerande nanosensorer tagits fram som kan övervaka natrium koncentrationer in vitro och in vivo. Baseras på jonselektiva optode teknik och består av mjukgjord polymera partiklar som natrium särskilt erkännande ^5,6 Dessa sensorer element, pH-känsliga fluoroforer, och tillsatser är inbäddade. ^7-9 Mekanistiskt extraherar natrium erkännande elementet natrium i sensorn. ¹⁰ Detta utvinning får pH-känsliga fluoroforen att släppa en vätejon för att upprätthålla ladda neutralitet i sensorn vilket orsakar en förändring i fluorescens. Natrium-sensorer är reversibel och selektiv för natrium än kalium även vid höga intracellulära koncentrationer. ⁶ De är ca 120 nm i diameter och är belagda med polyetylenglykol att ge biokompatibilitet. Använda mikroinjektion tekniker, kan sensorerna levereras i cytoplasman av celler där de har visat att övervaka den tidsmässiga och geografiska natrium dynamik slå hjärt myocyter. ¹¹ Dessutom har de spårat också realtid förändringar i natrium koncentrationer in vivo när det injiceras subkutant i möss ³ Häri förklarar vi i detalj och demonstrera metoder för att tillverka lysrör natrium nanosensorer och kort demonstrera biologiska tillämpningar vårt laboratorium använder nanosensorer för:. av mikroinjektion av sensorerna i celler, och subkutan injektion av sensorerna på möss .

Protocol

1. Beredning av optode

Innan den optode, alikvoter av komponenterna behöver så att de lätt kan mätas och lagras.

1. En 50 mg Natrium jonofor X (NaIX) flaska och en 50 mg natrium tetrakis [3,5-bis (trifluorometyl) fenyl] borat (NaTFPB) kommer varje tas upp i tetrahyrdofuran (THF) och alikvoteras till 1,5 centrifug ml polystyren rör. I en kemisk dragskåp, lös upp 50 mg NaIX i 1 ml THF inom rederibranschen flaskan och blanda för att säkerställa att den fasta helt har lösts upp. Överför 100 ìl av denna lösning i 10 separata centrifugrör. Upprepa för NaTFPB. Låt THF avdunsta i en kemisk dragskåp över natten, märka centrifugrör och placera dem i en 4 graders kylskåp för förvaring. Detta skapar 5 mg alikvoter av torra NaIX och NaTFPB.
2. Lös Chromoionophore III (CHIII) i 1 ml THF och överför till en 3 ml injektionsflaska av glas. Lägg till ytterligare 1 ml THF till CHIII sjöfarten injektionsflaskan för att lösa eventuella kvarstående CHIII och lägga detta till 3 ml injektionsflaska av glas. Det blir sammanlagt 2 ml nu. Överför 1 ml av CHIII i THF lösning på två separata 1,5 flaskor ml glasflaska med en teflonbelagd mössor. Förvara CHIII lösningen i en 4 graders kylskåp vid den slutliga koncentrationen på 5 mg / ml.

Dessa alikvoter och lösningar kommer att användas för att göra optode materialet.

3. Pipettera 66 ìl bis (2-etylhexyl) sebacat (DOS) i en 1,5 ml glasflaska med en teflonbelagd skruvlock - detta är optode flaskan. DOS är en trögflytande lösning så man måste vara uppmärksam för att säkerställa att rätt mängd lösning överförs till flaskan. Volymen motsvarar ca 60 mg DOS.
4. Väg upp 30 mg av hög molekylvikt poly (vinyl) klorid (PVC) och överför det till optode flaskan.
5. Nu lägger alikvoteras funktionella komponenter till optode flaskan för att skapa den önskade optode. Den relativa koncentrationer av CHIII, NaIX och NaTFPB avgör svaret från givaren till natrium. Dessa koncentrationer kan justeras för att ha en sensor som helst reagerar på intracellulära koncentrationer, med ett Kd på 10 mm eller extracellulära koncentrationer med ett Kd på 150 mm. Dessutom kommer det sannolikt att parti till parti variation av kemikalier från säljaren och kalibrering av sensorerna är nödvändigt att bestämma om rätt svar sker för varje nytt parti av kemiska komponenter. Här beskriver vi hur du skapar en sensor med halter som vanligtvis används för intracellulära natrium mätningar.
6. I en kemisk dragskåp, överföring 100 ìl av 5 mg / ml CHIII i THF lösning på optode flaskan.
7. Lös upp 5 mg NaIX i 300 ìl THF och överföra 300 l till optode flaskan, detta korrelerar till 5 mg NaIX.
8. Lös upp en 5 mg delmängd av NaTFPB i 500 ìl THF och överföra 20 ìl av lösningen på optode flaskan, detta korrelerar till 0,1 mg NaTFPB.
9. Tillsätt 80 ìl av THF till optode flaskan.
10. Lösningen i optode injektionsflaska innehåller 30 mg av PVC, 60 mg DOS, 5 mg NaIX, 0,2 mg NaTFPB, 0,5 mg CHIII i 500 l av THF. Vortexa försiktigt här flaskan tills alla PVC har löst sig. Den optode bör vara en röd färg. Den totala mängden THF läggs till injektionsflaskan ska 500 mikroliter oberoende av förhållandet av använda komponenter.
11. Låt resterande THF i NaIX och NaTFPB alikvoter att avdunsta över natten och märka röret med rätt mängd kemikalie.

2. Skapa nanosensorer

1. Pipettera 100 l på 10 mg / ml 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamine-N - [Methoxy (Polyetylenglykol) -550] i kloroform (PEG-lipid) till en 4 dram glasflaska. Låt kloroform avdunsta i en kemisk dragskåp. Denna process kan påskyndas genom torkning lösningen med kvävgas eller hus luft.
2. Tillsätt 4 ml av den önskade vattenlösning till injektionsflaskan med PEG-lipid. Placera flaskan på ett laboratorium domkraft under sonicating spets och höjer flaskan tills spetsen är ca 7 mm djupt i lösningen och låt ligga på en låg sonikering effekt i 30 sekunder. Här använder vi ett Branson digital sonifier satt till 15% amplitud med en ½ tums tip diameter steg horn. En vattenlösning kan vara en lösning. Till exempel, för att avgöra ett svar från de sensorer vi använder 10 mM HEPES pH 7,2 med trizma bas.
3. Medan lösningen är sonicated, blanda 50 ìl av optode material med 50 ìl av diklormetan i ett 0,6 ml mikrocentrifugrör. Blanda med pipetten för att säkerställa en jämn blandning.
4. Justera sonifier kontrollen till Sonikera i 3 minuter. Starta sonication och medan sonicating tillsätt optode blandningen lösning till injektionsflaskan genom att sänka ner pipettspetsen i lösningen och fördela den 100 l lösning i en snabb, även injektion. Lösningen ska bli blå, DepeENDE på vilken vattenlösning.
5. Låt sonication att fortsätta i ungefär 30 sekunder och sedan sänka domkraften så att sonicating spets är ca 2 mm djupt i lösning. Detta bör börja lufta lösningen och lösningen blir ogenomskinlig. Detta steg hjälper till att avlägsna kvarvarande THF och diklormetan från lösningen.
6. När sonication är klar, dra upp Nanosensorn lösningen i en 5 ml spruta. Fäst ett 0,2 filter ìm spruta och dosera Nanosensorn lösningen i en injektionsflaska av glas med skruvlock lock. Lösningen ska vara klar och blå om en vattenlösning som innehåller mindre än 10 mm natrium och har ett pH lägre än ca 9 används. Annars bör det inte ha någon färg eller vara rosa.

3. Bestämma nanonsensor svar

Denna metod används för att bestämma svar nanosensorer för att mäta intracellulära natrium. Olika koncentrationer rekommenderas att användas för extracellulära nanosensorer natrium koncentration.

1. Gör stamlösningar av 10 mm HEPES (0 Na) och 1M natriumklorid (NaCl) i 10 mM HEPES (1 M Na) och pH var och en av dessa lösningar till 7,2 med hjälp av trizma bas. Blanda stamlösningar av 0 Na och 1 M Na i 50 ml koniska centrifugrör för att skapa lösningar med: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mm NaCl koncentrationer.
2. Använd en optisk botten 96 brunnar för att bestämma svaret. Tillsätt 100 ìl av varje koncentration av natrium till 3 brunnar i en kolumn. Detta ger en rad 3 x 10 brunnar.
3. Till varje brunn tillsätt 100 ìl av nylagade nanosensorer och ladda in en mikroplattor fluorometer. Vi använder en molekylär Devices Spectramax M3.
4. Läs varje brunn med följande våglängder:

Excitation (nm)	Emission (nm)	Cut-Off (nm)
488	570	530
488	670	610
639	680	665

Den Nanosensorn intensiteten vid varje våglängd är beroende av natrium koncentration. Användningen av våglängden beroende av de tillämpningar. För intracellulära långsam dynamik mätningar, använder vi 488 nm/570 nm (excitation / emission) och 488 nm/670 nm, som tillåter oss att förhållandet de två våglängder och minska buller.

5. Traditionellt är optode uppgifter konverteras till ett värde som är: α = (I - I _min) / (I _max - I _min), där jag är intensiteten vid en given natriumhalt, jag _min är den lägsta intensiteten i svaret mätningar , och jag _max är den högsta intensiteten i svaret mätningar. Konvertera detta procenttal av intensitet vid 570 nm dividerat med intensitet på 670 nm eller intensiteten på 680 nm till α.
6. Använd plottning programvara, antingen Excel eller Origin vanligtvis används i våra labb, för att rita α kontra logg av natrium koncentration, inställning loggen noll natrium koncentration till -1. Montera en sigmoidal kurva till svaret. Från kurvan, beräkna natriumkoncentration på α = 0,5 som representerar den koncentration vid vilken sensorn optimalt svarar.
7. Justera förhållandet CHIII, NaIX och NaTFPB i optode att skapa nanosensorer med optimal respons runt natriumkoncentration av intresse.

4. Intracellulär imaging

1. För intracellulära mätningar är nanosensorer görs i 5 mg / ml glukos i vatten och idag injiceras in i cellerna.
2. Växa eller överföra celler till ett glas botten maträtt eller en avbildning kammare med ett glas täckglas botten.
3. Inkubera cellerna i tydliga media eller Tyrode lösning. Montera avbildning kammare eller maträtt på en epifluorescensmikroskop. Vi använder en Zeiss LSM 7 konfokalmikroskop.
4. Dra kapillär glas med en pipett avdragare. Vi använder en Sutter flammande brun p-97 med 1 mm OD, 0,78 mm ID glas, med ett sista tips diameter kring 300-500 nm.
5. Återfyllning pipetten med Nanosensorn hjälp av en spruta och en Hamilton nål eller en microtip lastare och en pipett.
6. Montera pipett till en hållare som är ansluten till en mikromanipulator och ansluts till tryckreglerade insprutningssystemet. Här använder vi en Burleigh EXFO PCS 6000 mikromanipulator och en medicinsk Systems Corporation injektor.
7. Sänk pipetten på toppen av cellen och in i cytoplasman, ibland är det nödvändigt att "trycka" manipulatorn innehavaren att tränga igenom membranet. Injicera Nanosensorn lösning och snabbt dra tillbaka pipetten.

5. In vivo imaging

Alla rutiner har granskats och godkänts av Northeastern universitets Djurvård och användning kommittén.

1. Nanosensorerför in vivo, är extracellulära bildbehandling görs i fosfatbuffrad saltlösning och justeras för att få ett optimalt svar på natrium i en natriumhalt på 135 mm.
2. För injektionen uppsättning och avbildning av fluorescerande nanosensorer på möss använder vi IVIS Lumina II och dess tillhörande anestesi enhet. Desinficera induktion och kammare avbildning. Place CD1 nakna möss (ca 20g) i induktionskammare och utsätta dem för isofluran. Andelen av isofluran och syre administreras flöde kommer att variera beroende på art och vikt av möss. Vänta på möss att bli helt sövd.
3. Efter att möss är sövd, ta bort möss från induktionskammare och placera in i bildbehandling kammaren. Håll möss under narkos. För varje mus, desinficera önskat injektionen områden.
4. Fyll en steril 31G insulin spruta med 10 mikroliter av nanosensorer att se till att ta bort alla luftbubblor.
5. Använd pincett, ta tag ett litet hudveck längs baksidan av musen på önskad injektionsstället. Medan greppa huden och för in sprutan i huden med fasade uppåt och nålen parallellt med huden.
6. Före injicering sensorerna, dra tillbaka sprutkolven för att säkerställa att nålen inte sätts in i ett blodkärl. Sedan rör försiktigt nålen höger och vänster för att skapa en ficka i huden. Detta minimerar mottryck som gör att sensorerna att läcka ut från injektionsstället. Injicera sensorer och försiktigt ta bort sprutan.
7. Tryck försiktigt på injektionsstället och torka bort någon lösning som kan ha läckt ut från injektionsstället. Detta minimerar fluorescensen från givare som inte injiceras i huden.
8. Upprepa steg 5,4 till 5,7 tills önskat antal injektion områden nås. Sex injektionsställen jämnt fördelade på vänster och höger sida av ryggen rekommenderas. För varje enskild mus, ändra nålar om nålen blir svårt att sätta in i huden. Nålar inte bör delas mellan möss. Detta minimerar smittspridning eller korskontaminering bland möss.
9. För avbildning natrium fluorescerande sensorer, förvärvar vi både brightfield och fluorescerande bilder av möss med filtret sätter som bäst matchade de 640 nm/680 nm (excitation / emission) spektrum av nanosensorer och som också minimerar autofluorescens i huden.

6. Representativa resultat

Figur 1. Responskurvor av fem olika Nanosensorn-apparater till natrium. Varje set representerar nanosensorer från olika optode formuleringar som hade samma mängd CHIII, NaTFPB, PVC och DOS men varierande mängder NaIX. Uppgifterna konverterades till α värden med 639/680 nm intensiteter. Uppgifterna är ett genomsnitt 3, felstaplar utelämnats för tydlighetens skull, med en monterad sigmoidal kurva med Origin. I detta responskurva var den högsta koncentration av natriumtiosulfat som 500 mm. Kd av natrium nanosensorer för natrium varierade från 10 mm (orange diamanter) till ca 150 mm (svarta rutor).

Figur 2. Injiceras neonatal hjärt myocyter. Celler odlades på coverglass, monterad på ett mikroskop och injiceras med natrium nanosensorer. Visas är fluorescerande (639 nm excitation), brightfield och overlay. Observera att vissa givare klustring uppstår, men cellerna har normal morfologi, sensorer har spritt i hela cytosolen och det finns ingen kärnkraft lastning.

Figur 3. Subkutan injektion av möss med natrium nanosensorer. Nio olika injektioner av natrium nanosensorer gjordes i subkutan loppet av nakna möss. Både ljusa fält och fluorescerande bilder (640/680) är överlappande.

Discussion

Bildandet av nanosensorer bör inte ta längre än 10 minuter efter att den optode lösningen har gjorts och PEG lipid torkat. Optode kan inte bara göras snabbt när det behövs, men när det förvaras vid 4 grader Celsius, kan de vara stabil i månader. Vi har visat att nansensors, en gång bildats, är stabila i lösning under minst en vecka,. Dock måste försiktighet iakttas för att förhindra fotoblekning under denna tid genom att blockera nanosensorer från ljus ⁶ Medan natrium nanosensorer visades här, har optodes varit skapas för de flesta biologiskt relevanta joner som kalium och klorid. ^10,12 Vi har även utökat denna teknik till små molekyler såsom glukos. ¹³

Förutom att skapa nanosensorer för att övervaka olika analyter, dessa nanosensorer kan bli föremål för andra förändringar som gör dem användbara i de flesta biologiska experiment. Till exempel, ytbeläggning, i detta fall poly (etylenglykol), kan lätt ändras med någon amfifila molekyl som är vattenlösligt. Detta gör att möjligheten att functionalizing dessa nanopartiklar för olika applikationer eller mål. Storleken på nanopartiklar kan också justeras genom att ändra ytbeläggning, det sonication intensitet eller lösningsmedel som används.

Kalcium fluorescerande indikatorer har varit ovärderliga för att avgöra intracellulär kalcium signalering, men ingen tillgänglig natrium känsliga färgämnen har samma ideal egenskaper. Optode nanopartiklar avsedda att ge en alternativ metod för avbildning joner intracellulärt har varit under utveckling i år. ¹⁴ Vi har byggt på denna tidigare forskning för att skapa nanosensorer specifika för intracellulära natrium bildbehandling som förhoppningsvis kommer att erbjuda ett sätt att förstå hur natrium-signalering påverkar cellfunktioner och förändringar i signalering som leder till vissa sjukdomar.

Användningen av fluorescerande nanosensorer in vivo ger en i realtid minimal-invasiva alternativ för övervakning av analyter än andra metoder såsom blod drar. ³ Natrium och nanosensorer glukos baserad på tekniken ovan har visat att spåra ändringar i natrium och glukos, respektive i vivo. ^3,13 Det finns dock för närvarande finns begränsningar för denna metod som ett verktyg för uppföljning. Till exempel måste givarna innehålla en fluoroforen med ett spektrum tillräckligt förskjutits mot det nära infraröda rött för att minimera bakgrunden autofluorescens från huden. ¹⁵ andra tillverkar den aktuella injektionsteknik inte enhetlig injektion av nanosensorer som kan orsakas av sådana fel som variation i injektion djup. Trots dessa begränsningar kan utvecklingen av dessa fluorescerande nanosensorer och lyckad demonstration göra dessa sensorer en ovärderlig forskning verktyg och metod för övervakning av patienters hälsa.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina II Instrument Package	Caliper Life Sciences	126273
CD-1 Nude Mice	Charles River Laboratories	Strain Code: 086	Immunodeficient
Insulin syringes	BD Biosciences	328438	3/10 ccmL , 8mm, 31G
High Molecular Weight PVC	Sigma-Aldrich
DOS	Sigma-Aldrich
CHIII	Sigma-Aldrich
NaTFPB	Sigma-Aldrich
NaIX	Sigma-Aldrich
Thin walled capillary glass	Sutter Instrument Co.
PEG lipid	Avanti Polar Lipid, Inc
Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma.