Summary
Nanopartículas fluorescentes produzidas em nosso laboratório são usados para concentrações de íons de imagem e fluxos de íons em sistemas biológicos como as células durante o fluido intersticial durante sinalização e homeostase fisiológica.
Abstract
Homeostase de íons estreitamente regulada por todo o corpo é necessário para a prevenção de tais estados debilitantes como a desidratação. 1 Por outro lado, íons rápida no nível celular são necessários para iniciar os potenciais de ação em células excitáveis. Dois regulação de sódio desempenha um papel importante em ambos Nestes casos, no entanto, nenhum método existe atualmente para o monitoramento contínuo dos níveis de sódio in vivo 3 e 4 sondas de sódio intracelular não fornecem resultados semelhantes detalhada como sondas de cálcio. Em um esforço para preencher esses dois vazios, nanosensores fluorescentes foram desenvolvidos que podem monitorar as concentrações de sódio in vitro e in vivo. 5,6 Estes sensores são baseados em tecnologia de íon-seletivo optode e consistem de partículas poliméricas plastificadas em que o reconhecimento de sódio específicas elementos, pH-sensíveis fluoróforos, e aditivos são incorporados. 7-9 mecanicamente, o elemento de reconhecimento de sódio extratos de sódio para o sensor. 10 Essa extração faz com que o fluoróforo pH-sensíveis para liberar um íon hidrogênio para manter a neutralidade de carga dentro do sensor que faz com que uma mudança de fluorescência. Os sensores de sódio são reversíveis e seletivos para sódio mais potássio, mesmo em altas concentrações intracelulares. 6 Eles são cerca de 120 nm de diâmetro e são revestidos com polietileno glicol para dar biocompatibilidade. Usando técnicas de microinjeção, os sensores podem ser entregues no citoplasma das células onde foram mostrados para acompanhar a dinâmica temporal e espacial de sódio de bater miócitos cardíacos 11. Além disso, eles também têm rastreado em tempo real, alterações nas concentrações de sódio in vivo quando injetado por via subcutânea em camundongos 3 Aqui, vamos explicar em detalhe e demonstrar a metodologia para a fabricação de nano-sensores de sódio fluorescente e brevemente demonstrar a aplicações biológicas nosso laboratório utiliza o nanosensores para:. da microinjeção dos sensores em células, e da injeção subcutânea dos sensores em camundongos .
Protocol
1. Preparação de optode
Antes de fazer a optode, alíquotas dos componentes são necessidade para que eles possam ser facilmente medidos e armazenados.
- A 50 mg de sódio do ionóforo X (naix) e um frasco de sódio 50 mg tetraquis [3,5-bis (trifluorometil) fenil] borato (NaTFPB) cada um deles será criado em tetrahyrdofuran (THF) e alíquotas de 1,5 ml em tubos de centrifugação de poliestireno. Em uma Cobertura de vapores químicos, dissolver o de 50 mg de naix em 1 ml de THF no frasco de transporte e mistura para assegurar que o sólido tenha dissolvido completamente. Transferência de 100 ml desta solução para 10 tubos de centrífuga separados. Repita o procedimento para NaTFPB. Permitir que o THF para evaporar em uma Cobertura de vapores químicos durante a noite, os tubos de centrifugação rótulo e colocá-los no frigorífico grau 4 para o armazenamento. Isso cria cinco alíquotas mg de naix seco e NaTFPB.
- Dissolver o III Chromoionophore (CHIII) em 1 ml de THF e transferir para um frasco de vidro de 3 ml. Adicionar outro 1 ml de THF para o frasco de transporte CHIII para dissolver qualquer CHIII residual e adicionar esta para o frasco de vidro de 3 ml. Haverá um total de 2 ml agora. Transferir 1 ml da solução CHIII em THF a dois frascos separados 1,5 ml de vidro com tampas de Teflon um revestido. Conservar a solução CHIII no frigorífico grau 4, na concentração final de 5 mg / ml.
Essas alíquotas e soluções serão usadas para fazer o material optode.
- Pipeta mL 66 de bis (2-etil-hexil) sebacato (DOS) em um frasco de vidro de 1,5 ml com tampa de rosca em Teflon - este é o frasco optode. DOS é uma solução viscosa para cuidados devem ser tomados para garantir a quantidade adequada de solução é transferido para o frasco. O volume corresponde a ~ 60 mg de DOS.
- Pesar 30 mg de alto peso molecular poli cloreto (PVC) (PVC) e transferir isso para o frasco optode.
- Agora adicione os componentes funcionais alíquotas para o frasco optode para criar o optode desejado. As concentrações relativas de CHIII, naix e NaTFPB irá determinar a resposta do sensor de sódio. Estas concentrações podem ser ajustados para ter um sensor que, idealmente, responde a concentrações intracelulares, com um Kd de 10 mM ou concentrações extracelular, com um Kd de 150 mM. Além disso, haverá provavelmente de lote para lote variabilidade dos produtos químicos do fornecedor e de calibração dos sensores é necessário determinar se a resposta correta está ocorrendo para cada novo lote de componentes químicos. Aqui nós descrevemos o método para criar um sensor com concentrações que são normalmente utilizados para medições de sódio intracelular.
- Em uma Cobertura de vapores químicos, a transferência de 100 l do 5 mg / ml CHIII em THF solução para o frasco optode.
- Dissolver 5 mg de naix em 300 ml de THF e transferir 300 ml para o frasco optode, este se correlaciona com 5 mg de naix.
- Dissolver uma alíquota de 5 mg do NaTFPB em 500 mL de THF e transferência de 20 l da solução para o frasco optode, este se correlaciona com 0,1 mg de NaTFPB.
- Adicionar 80 mL de THF ao frasco optode.
- A solução no frasco optode contém 30 mg de PVC, 60 mg de DOS, 5 mg de naix, 0,2 mg de NaTFPB, 0,5 mg de CHIII em 500 mL de THF. Suavemente vortex frasco este até que todos os PVC se dissolveu. O optode deve ser uma cor vermelha. A quantidade total de THF adicionada ao frasco deve ser de 500 mL, independentemente da relação de componentes utilizados.
- Permitir que o THF restante no naix e alíquotas NaTFPB para evaporar durante a noite e re-rotular o tubo com a quantidade correta de produtos químicos.
2. Criando nanosensores
- Pipetar 100 mL de 10 mg / ml 1,2-Distearoyl-sn-glicero-3-Phosphoethanolamine-N - [Methoxy (polietilenoglicol) -550] em clorofórmio (PEG lipídios) em um frasco de vidro 4 dram. Permitir que o clorofórmio para evaporar em uma Cobertura de vapores químicos. Este processo pode ser acelerado por secagem a solução com azoto ou ar da casa.
- Adicionar 4 ml da solução aquosa desejado para o frasco com PEG lipídios. Coloque o frasco em um jack de laboratório sob a ponta sonicando e elevar o frasco até que a ponta é cerca de 7 mm de profundidade na solução e sonicate a uma potência baixa sonicação por 30 segundos. Aqui usamos um Branson digitais sonifier definido para amplitude de 15% com um centímetro da ponta do chifre ½ passo diâmetro. A solução aquosa pode ser qualquer solução. Por exemplo, para determinar a resposta dos sensores usamos 10 mM HEPES pH 7,2 com base Trizma.
- Enquanto a solução está sendo sonicado, misturar 50 ul do material optode com 50 ul de diclorometano em um tubo de microcentrífuga de 0,6 ml. Misturar com a pipeta para garantir uma mistura uniforme.
- Ajuste o controle sonifier para sonicate por 3 minutos. Iniciar a sonicação e enquanto sonicando adicionar a solução de mistura optode ao frasco por imersão a ponta da pipeta na solução e dispensar as mL de solução 100 em uma rápida, a injeção mesmo. A solução deve ficar azul, depending na solução aquosa utilizada.
- Permitir que a sonicação para continuar por aproximadamente 30 segundos depois abaixe a tomada de modo que a ponta sonicando é de cerca de 2 mm de profundidade em solução. Isso deve começar a arejar a solução ea solução vai se tornar opaco. Este passo ajuda a remover a THF residual e diclorometano da solução.
- Uma vez sonicação é completa, puxar para cima a solução nanosensor para uma seringa de 5 ml. Anexar um filtro de seringa de 0,2 mm e dispensar a solução nanosensor em um frasco de vidro com tampa de tampa de rosca. A solução deve ser claro e azul se uma solução aquosa que contém menos de 10 mM de sódio e tem um pH inferior a cerca de 9 é usado. Caso contrário, ele não deve ter cor ou ser rosa.
3. Determinação da resposta nanonsensor
Este método é usado para determinar a resposta de nanosensores projetado para medir de sódio intracelular. Concentrações diferentes são recomendados para ser usado para nanosensores concentração extracelular de sódio.
- Faça soluções estoque de 10 mM HEPES (0 Na) e cloreto de sódio 1M (NaCl) em 10 mM HEPES (1 M Na) e pH cada uma destas soluções para 7,2 usando base Trizma. Mix de soluções estoque de 0 e 1 M Na Na, em 50 ml tubos de centrífuga cônico para criar soluções com: 0, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 mM concentrações de NaCl.
- Use um fundo óptico placa de 96 poços para determinar a resposta. Adicione 100 ml de cada concentração de sódio a 3 poços em uma coluna. Isto irá produzir uma série de 3 x 10 poços.
- A cada poço adicionar 100 ul de nanosensores preparados na hora e carregar em um fluorímetro de microplacas. Nós usamos um Molecular Devices Spectramax M3.
- Leia todos os poços com os comprimentos de onda a seguir:
| Excitação (nm) | Emissão (nm) | Cut-Off (nm) |
| 488 | 570 | 530 |
| 488 | 670 | 610 |
| 639 | 680 | 665 |
A intensidade nanosensor em cada comprimento de onda é dependente da concentração de sódio. O uso do comprimento de onda depende das aplicações. Intracelular para medições lenta dinâmica, usamos 488 nm/570 nm (excitação / emissão) e 488 nm nm/670 que nos permitem a relação dois comprimentos de onda e reduzir o ruído.
- Tradicionalmente, optode dados são convertidos para um valor que são: α = (I - I min) / (I max - I min), onde I é a intensidade em uma concentração de sódio dado, eu min é a menor intensidade nas medidas de resposta , e eu max é a maior intensidade nas medidas de resposta. Converter se essa relação de intensidade a 570 nm dividida pela intensidade a 670 nm ou a intensidade a 680 nm para α.
- Use software de plotagem, Excel ou origem são normalmente utilizados em nosso laboratório, para traçar α versus o log da concentração de sódio, definindo o log da concentração de sódio de zero a -1. Ajustar uma curva sigmoidal para a resposta. A partir da curva, calcular a concentração de sódio a α = 0,5, que representa a concentração na qual o sensor ideal responde.
- Ajustar a relação de CHIII, naix e NaTFPB na optode para criar nanosensores com ótima resposta em torno da concentração de sódio de interesse.
4. Imagem intracelular
- Para medições intracelular, o nanosensores são feitas em 5 de glicose mg / ml em água e microinjeção para as células.
- Crescer ou transferência de células para um prato fundo de vidro ou uma câmara de imagem com um fundo lamela de vidro.
- Incubar as células em meios de comunicação clara ou solução Tyrode é. Monte a câmara de imagem ou um prato em um microscópio de epifluorescência. Nós usamos uma Zeiss LSM 7 microscópio confocal.
- Puxe capilar de vidro com um puxador de pipeta. Nós usamos um Sutter flamejante marrom p-97 com 1 mm de diâmetro externo, 0,78 mm de diâmetro de vidro, com um diâmetro em torno de 300-500 ponta final nm.
- Reaterro da pipeta com a solução nanosensor usando uma seringa e uma agulha Hamilton, ou um carregador MICROTIP e uma pipeta.
- Monte a pipeta em um suporte que é acoplado a um micromanipulador e conectados a um sistema de injeção de pressão controlada. Aqui usamos um Burleigh EXFO micromanipulador 6000 PCS e uma médica sistemas corporação injector.
- Inferior a pipeta no topo da célula para o citoplasma e, às vezes é necessário "tocar" o titular do manipulador para perfurar a membrana. Injectar a solução nanosensor e rapidamente retirar a pipeta.
5. In vivo de imagens
Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pela Northeastern University de Cuidados Animal e Uso Comissão.
- Nanosensorespara in vivo, imagens extracelular são feitas em tampão fosfato salina e ajustado para ter uma resposta óptima de sódio em uma concentração de sódio de 135 mM.
- Para a injeção de configuração e imagem do nanosensores fluorescentes em camundongos, usamos o IVIS Lumina II e sua unidade de anestesia associada. Desinfectar a indução e câmaras de imagem. Lugar CD1 camundongos nude (aproximadamente 20g) na câmara de indução e expô-los a isoflurano. A porcentagem de vazão isoflurano e oxigênio administrado irá variar dependendo da espécie e peso de ratos. Aguarde os ratos para se tornar totalmente anestesiado.
- Depois de os ratos são anestesiados, remover os ratos da câmara de indução e coloque dentro da câmara de imagem. Manter os ratos sob anestesia. Para cada rato, desinfectar as áreas de injeção desejada.
- Encha uma seringa de insulina estéreis 31G com 10 mL de nanosensores certificando-se de remover todas as bolhas de ar.
- Utilizando uma pinça, segure uma pequena prega de pele ao longo das costas do mouse no local da injeção desejada. Ao segurar a pele, insira a seringa na pele com o bisel voltado para cima e agulha, paralelamente à pele.
- Antes de injetar os sensores, puxe o êmbolo da seringa para garantir a agulha não está inserido em um vaso sanguíneo. Então, gentilmente mover a agulha direita e esquerda para criar um bolso dentro da pele. Isso irá minimizar a pressão de volta que faz com que os sensores de vazamento para fora do local da injeção. Injetar os sensores e remova cuidadosamente a seringa.
- Aplique uma suave pressão no local da injecção e limpe qualquer solução que pode ter vazado para fora do local da injeção. Isso irá minimizar a fluorescência dos sensores que não são injetadas na pele.
- Repete as etapas 5,4 a 5.7 até que o número de áreas de injeção desejada seja atingida. Seis locais de injeção espaçados no lado esquerdo e direito das costas são recomendados. Para cada rato individual, a mudança de agulhas, se a agulha torna-se difícil inserir na pele. Agulhas não devem ser compartilhadas entre camundongos. Isso irá minimizar a transmissão da doença ou contaminação cruzada entre os ratos.
- Para geração de imagens dos sensores de sódio fluorescente, que adquirir imagens tanto claro e fluorescente dos camundongos usando conjuntos de filtros que mais se igualava os 640 nm/680 nm (excitação / emissão) espectro da nanosensores e que também minimizar a autofluorescência da pele.
6. Resultados representante
Figura 1. Curvas de resposta de cinco diferentes conjuntos nanosensor ao sódio. Cada conjunto representa nanosensores a partir de formulações optode diferentes que tinham a mesma quantidade de CHIII, NaTFPB, PVC e DOS, mas quantidades variáveis de naix. Os dados foram convertidos para valores α usando a intensidades 639/680 nm. Os dados são uma média de 3 barras, o erro omitidos para maior clareza, com uma curva sigmoidal equipado com Origin. Nesta curva de resposta, a concentração máxima de sódio utilizado foi de 500 mM. Kd o da nanosensores de sódio de sódio variou de 10 mM (diamantes laranja) para cerca de 150 mM (quadrados pretos).
Figura 2. Injected neonatal miócitos cardíacos. As células foram cultivadas em lamínula, montado em um microscópio e injetados com nanosensores de sódio. Mostrados são fluorescentes (excitação nm 639), brightfield e sobreposição. Observe que alguns clusters de sensor ocorre, mas as células têm morfologia normal, sensores têm difundido em todo o citosol e não há nenhuma carga nuclear.
Figura 3. Injeção subcutânea de camundongos com nanosensores de sódio. Nove injeções diferentes de nanosensores de sódio foram feitas para o espaço subcutâneo de ratos nude. Tanto o campo brilhante e imagens fluorescentes (640/680) são sobrepostas.
Discussion
A formação de nanosensores não deve demorar mais que 10 minutos uma vez a solução optode foi feito e os lipídios PEG secas. Optode não só podem ser feitas rapidamente, quando necessário, mas quando armazenado a 4 graus Celsius, que pode ser estável por meses. Nós mostramos que o nansensors, uma vez formadas, são estáveis em solução de pelo menos uma semana;. Porém, cuidados devem ser tomados para evitar fotobranqueamento ao longo deste tempo, bloqueando a nanosensores da luz 6 Enquanto nanosensores de sódio foram demonstrados aqui, optodes foram criado para a maioria dos íons biologicamente relevantes, tais como potássio e cloreto. 10,12 Temos também estendeu essa tecnologia para pequenas moléculas como a glicose 13.
Além de gerar nanosensores para monitorar diferentes analitos, estes nanosensores são passíveis de outras mudanças que irá torná-los úteis em experimentos mais biológico. Por exemplo, o revestimento de superfície, neste caso, poli (etileno glicol), pode facilmente ser mudado usando qualquer molécula anfifílicos que é solúvel em água. Isto permite a possibilidade de funcionalização essas nanopartículas para aplicações diferentes ou metas. O tamanho das nanopartículas também podem ser ajustados alterando o revestimento de superfície, a intensidade de sonicação ou o solvente utilizado.
Indicadores de cálcio fluorescentes foram inestimáveis na determinação de sinalização intracelular de cálcio, no entanto, não corantes sódio disponível sensíveis têm as mesmas características ideal. Optode nanopartículas pretende fornecer um método alternativo para íons de imagem intracelularmente tem estado em desenvolvimento há anos. 14 Temos construído sobre essa pesquisa anterior para criar nano-sensores específicos para geração de imagens de sódio intracelular que venha a fornecer um meio para entender como sinalização de sódio afeta a função celular e alterações na sinalização que levam a determinadas doenças.
O uso de nanosensores fluorescente in vivo oferece um tempo real alternativa minimamente invasiva para analitos monitoramento sobre outros métodos, tais como sangue empates. 3 de sódio e glicose nanosensores baseado na tecnologia acima foram mostrados para acompanhar as mudanças em sódio e glicose, respectivamente, em vivo. 3,13 No entanto, atualmente existem limitações a este método como uma ferramenta de monitoramento. Por exemplo, os sensores devem conter um fluoróforo com um espectro suficientemente deslocado para o vermelho do infravermelho próximo, a fim de minimizar a autofluorescência de fundo da pele. 15 Em segundo lugar, a técnica de injeção de corrente não produz injeção uniforme da nanosensores que podem ser causados por tais erros como variação na profundidade da injeção. Apesar destas limitações, o desenvolvimento destas nanosensores fluorescentes e sua demonstração bem sucedida poderia fazer esses sensores uma valiosa ferramenta de pesquisa e método para monitorar a saúde do paciente.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
JMD e MKB são financiados através da Ciência e Nanomedicina IGERT programa Tecnologia na Northeastern University (financiamento do NCI e conceder NSF DGE-0504331). Este trabalho também foi financiado pelo National Institutes of Health National Institute of General Medical Sciences Grant R01 GM084366. Agradecemos também Saumya Das e Anthony Rosenzweig de BIDMC em Boston para a prestação de miócitos cardíacos e Cash Kevin por sua contribuição no desenvolvimento do protocolo animal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| IVIS Lumina II Instrument Package | Caliper Life Sciences | 126273 | |
| CD-1 Nude Mice | Charles River Laboratories | Strain Code: 086 | Immunodeficient |
| Insulin syringes | BD Biosciences | 328438 | 3/10 ccmL , 8mm, 31G |
| High Molecular Weight PVC | Sigma-Aldrich | ||
| DOS | Sigma-Aldrich | ||
| CHIII | Sigma-Aldrich | ||
| NaTFPB | Sigma-Aldrich | ||
| NaIX | Sigma-Aldrich | ||
| Thin walled capillary glass | Sutter Instrument Co. | ||
| PEG lipid | Avanti Polar Lipid, Inc | ||
| Table 1. Provides a list of chemicals and equipment used in this procedure. All common chemicals not listed were purchased from Sigma. | |||
References
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