Summary
准备成人的标准方法
Abstract
果蝇一直被用来作为模型系统，研究发展，主要是由于与它的基因听话的难易程度。多年来，众多的突变株和技术技巧已经制定，让复杂的问题要问，并在合理的时间内回答。到所有已知的主要信号转导通路的组成部分的相互作用的基本观点已得到正向和反向基因果蝇的研究。苍蝇的眼睛已被证明是非常好，适合突变分析，因为，在实验室条件下，苍蝇可以生存无功能的眼睛。此外，虫眼的表面是由一些个别单位800眼（面或小眼），形成了定期，表面光滑时，看着在解剖显微镜下。因此，很容易看到是否突变可能会影响眼睛发育或外部表面光滑的损失（“粗糙眼”的表型;图1）。增长或整体眼睛的大小，分别为（基于屏幕的例子外眼形态， 例如 ：1） 。随后的详细分析，眼表型需要固定，塑料包埋薄切片和成人的眼睛。
果蝇眼睛的发展，从所谓的眼成虫光盘，一包上皮细胞增殖，并在幼虫和蛹的阶段区分（审查， 如 2） 。每个ommatidium由20个细胞，其中包括8个光感受器（PR或R -细胞，图2），4个镜头分泌的视锥细胞，色素细胞（“六角”周围的R -细胞集群）和猪鬃。每个ommatidium的光感受器，最容易确定其对光敏感的细胞器，rhabdomeres，是一个梯形六“外”（R1 - 6）和两个“内在的”光感受器（R7 / 8举办R8 [图2]下面是R7的，因此只在更深的领域从眼球的部分）。每个面的梯形是其邻国和整体正位眼（图3A）和背腹轴的精确对准。特别是，背，腹（黑色和红色箭头，分别）半眼的小眼是互为镜像，对应在平面细胞极性的信号（ 审查见如3）建立了两个手性形式。
这里描述的方法来生成半薄眼的部分（如在图3中提出的）从最初Tomlinson和准备 4描述的略有修改。它允许所有细胞的形态分析，除了透明的视锥细胞。此外，色素的R -细胞（蓝色箭头在图2和3）可以用来作为一个R -细胞的基因型的细胞自主的标志，在一个子集的R -细胞可以遗传的基因因此要求很容易地确定5,6。
Protocol
1。飞头夹层
- 确保你手头上的所有材料（包括明胶涂层幻灯片）。准备戊二醛和锇固定液（见下文）。每基因型嵌入，分装在1.5毫升冰管200μL戊二醛修复方案。
- 麻醉的CO 2垫（一个头是在过程中被摧毁，我们通常解剖七个飞头嵌入的情况下，每基因型6）上的苍蝇。
- 保持和稍微按胸部飞，背侧，镊子，用锋利的手术刀切断的头部。
- 稳定飞头颈部接触镊子，小心地切了一只眼的一小部分。这增强了固定液的渗透（如果你打算使用克隆分析你的眼睛部分，削减与没有或较小的克隆的眼睛）。避免触摸和破坏完整的眼睛，稍后将切片。
- 触摸切断眼表面的镊子或手术刀头和转移冰头戊二醛/磷酸固定液（元首经常漂浮在固定液上）解剖的元首不应该保持更长的时间修复在戊二醛超过15分钟前锇此外。与同一基因型的其他苍蝇重复步骤1.2 - 1.5。
2。固定和嵌入（所有步骤中使用的手套！）
- 自旋为1分钟，以10,000 rpm的Eppendorf离心机flyheads。继续即使头不下沉。
- OSO 4溶液中加入200μL和修复至少30分钟，长达1小时在冰上。
- 使用巴斯德吸管，去除戊二醛/锇的解决方案（请务必使用适当的废物处理程序！）和200μL锇溶液取代。在冰上孵育1-6小时。始终确保磁头与液体完全覆盖，永远不会删除所有的解决方案作为元首或眼睛可能崩溃！
- 使用巴斯德吸管，弃固定液，在冰上至少5分钟增加0.5 -1毫升30％的乙醇和孵化（确保使用适当的废物处理程序，因为现在的乙醇包含锇！）。
- 50％，70％（80％），90％和100％的两倍乙醇重复上述步骤。如果用电子显微镜分析的眼睛，包括80％的乙醇一步。 70％的清洗步骤后，样品可以去除冰。
- 更换与环氧丙烷（易挥发，继续努力，在引擎盖）等体积的乙醇。孵育10分钟，在室温。
- 重复环氧丙烷洗。分批工作，如果并行处理的许多基因型，以避免崩溃的眼睛，由于环氧丙烷蒸发。
- 删除最环氧丙烷和使用塑料移液管，增加约500μL1:1的树脂：环氧丙烷的解决方案。在室温下，平衡过夜。
3。在模具的嵌入和安排
- 确保所有模具都贴上标签，保持跟踪您的不同基因型，然后填写100％的树脂模具。不要溢出（没有“高山”直整个模具表面时，在模具表面）。使用硬树脂EM分析。
- 使用移液管，除去50％的树脂元首，取代100％的树脂，并在室温下孵育3-4小时。主管与树脂渗透，他们将沉到试管底部。
- 使用牙签已经打在坚硬的表面，一旦创建一个小钩的，在时间转移到一个模具一个头。
- 铝箔放在工作区的解剖范围，以防止树脂泄漏。
- 用解剖针，虽然你的范围，漩涡在树脂的头微微仔细将其移动到模具底部接近尖端。
- 小心地将完整的（！）的眼睛（或你的未来如果你想有截面切片平面）颈部表面与模具的前墙，一定要保持眼睛的切线表面大约半个脑袋离模具壁的直径。在极少数情况下，眼球表面和头部的角质层之间的空白处，可看到一只眼睛崩溃。如果你有一个折叠的眼睛，取代它的第 7 次备用眼。
- 重复所有首长。一旦完成所有的路线，重新检查所有的目光，以确保他们不动，当您移除树脂针。
- 如果你有麻烦与眼睛移动，当您删除解剖针，位置所需的眼睛，迅速收回针稍稍远离头部，然后慢慢松开针完全。
- 烘烤模具一夜之间在70 ° C。
4。修整和切片
- 移除弯曲模具淬硬模具块，Keeping跟踪哪个块对应的基因型（如存储在小闪烁瓶）。
- 修剪，使用适合您的切片机，是装在一个树脂玻璃或铝块面对夹头。山块修剪，夹头的眼睛，。
- 在使用聚四氟乙烯涂层剃须刀的清扫范围的吩咐，小心地切断你的格挡只有顶层。这会留下一个清晰的表面，虽然你应该看到的眼睛，因此可以预测未来切片平面。避免削减你的手指！
- 切断头部两侧和前面多余的塑料（即用于模具的顶部，对准眼睛时），直到头部周围的塑料大部分被切断。最好是慢慢接近头部，切断多个塑料薄层。
- 使用干净的刀片，从眼睛上方小心取出你要节后面（通常切圆的眼睛，在一个很小的角度，原来的模具表面）在精确的平面超薄层。
- 继续，直到你刚开始切去眼球的外表面。确保您使用刀片的清洁区，以获得光泽，透明的表面，这使得在切片更容易对齐。
- 为了节省刀片，各地块的两侧修剪原油的刀片和老年人使用的精细剪裁（先切和4.6）的一个新的刀片。最后，您将有一个三面略有倾斜，切断顶部对应到你的未来截面金字塔。
- 安装在切片块。实际切片将切片类型而不同，并不会在这里详细介绍。我们用一个Sorvall MT5000一个HISTO质量钻石刀，切0.5〜1μm的部分。光镜下分析，截面厚度略有差异并不重要。如果切片白+基因，第一个克隆标记1μm的部分，以确保有足够的色素颗粒相邻（图2）每节rhabdomeres。
- 路段将浮在水面上。提起了一个木制的棉条从下面的水在旋转运动表面的扁平结束前20-30节，和他们转移到一滴水明胶镀膜玻璃幻灯片（上加热板保持在100℃左右）。
- 重复20-30节。等待，直到水蒸发和部分粘到幻灯片。通常情况下，3只眼的部分安排在三列双程证行（三只眼）（顶部/底部），放在一张幻灯片。
5。染色和显微镜分析
- 除非，切片克隆，染色部分。将滑动部分设置在加热块在90 ° C。甲苯胺蓝染色解决方案免除到0.22μm的过滤器连接到幻灯片从30毫升注射器和染色10秒。立即用蒸馏水冲洗广泛。空气干燥。
- 用塑料移液管，分发3滴的DPX安装介质上的幻灯片，并盖上盖玻片。顶部与3助攻，让安装介质（例如在室温过夜）硬化。
- 光学显微镜的图像。使用5倍或10倍镜头找到一个很好的部分，然后进行详细的分析和拍照切换到63X油浸镜头。我们通常使用相衬的设置，但暗场光学系统的工作，以及。
6。代表性的成果：
最常见的，眼睛是内嵌在一个塑料作为一种遗传屏幕的一部分或在测试与已知基因的影响无论是一般的眼睛结构或极性遗传相互作用的过程中检测到的外部粗糙眼表型的详细分析。眼睛部分的典型结果如图3所示。野生型的小眼（图3A）显示完整的感光补充色素细胞晶格包围。相反，在一个斜视 （AKA客梵高7 stbm，）突变体，ommatidial极性丢失，即使感光补充目前，旋转和手性是随机的（图3B）。此外，自stbm等位基因切片在AW -背景，色素颗粒在图失踪。 3B。图3C显示克隆分析的一个例子。果蝇Rho激酶（drok）ommatidial旋转以及 8眼结构的完整性的要求。色素的色素细胞和rhabdomeres（通常的情况下可以通过确定纯 合子 drok 2克隆， 克隆使用无眼，工党和一个P -元素补充的背景下瓦特强烈表达的白色标记基因-在野外突变诱导型和杂合组织）。因此，这是可能的，以确定他们缺乏色素突变的地区。由于色素沉着的细胞自主的R - CELLS提到，个别的R -细胞的基因型可确定（见箭头在图3c）。
图1。 果蝇的眼睛是极好的模型系统，因为生物学家，相反的野生型眼（一）表面光滑，突变的眼表面的外部经常粗糙（二），表明潜在的眼表型。在所有的数字，前左和背。图片礼貌，美国，新墨西哥州拉斯克鲁塞斯，新墨西哥州立大学博士詹妮弗柯蒂斯。
图2单小眼切片的光镜图像，使用所描述的方法。 R7的R8之上的谎言，因为只有七个R -细胞在每ommatidium时可见。 （A“）在R7，R7的细胞体内检测到R1和R6（黄色箭头”）之间。相比之下，在R8的水平（二），R8的细胞体是R1和R2之间（黄色箭头在B'）检测。蓝箭头标记可以用来作为一个自治细胞色素标记的色素颗粒。
图3。通过野生型（A）stbm（B）和drok（C）突变的成年果蝇眼睛的切线部分。下面的部分原理图显示极性的小眼（见箭头（一））。圆圈代表小眼感光补充的缺陷。黄线代表的背/腹对称线（赤道）。相反的野生型（一）面向小眼，平面组织失去了在stbm突变（二）。注意stbm突变节中缺乏色素由于其W -突变的背景。 （三）由于drok基因突变是致命的，他们必须在克隆分析。因此，色素细胞是野生型或杂合子（填充蓝色箭头），而缺乏的R -细胞色素（打开蓝色箭头）是纯合子突变。除了 旋转缺陷，drok突变体也表现出结构性缺陷，包括R -细胞的缺失或多余的号码。请注意，克隆分析，部分不染，以避免模糊的色素颗粒。
Discussion
用果蝇作为模式生物，导致遗传筛选确定的包括人类在内的高等真核生物中高度保守的信号途径所必需的基因家族的创始成员的许多。一直以来，在实验室条件下，功能的眼睛是为生存而可有可无，映入眼帘的是一个新基因功能的发现和基因网络的评估特别适合的组织。超微结构分析的飞眼睛使用的描述方法，从而导致发育和疾病相关的基本发现。最初，单细胞克隆进行分析，利用X射线诱导密切相关的隐性标记的细胞自治相结合，克隆项目。最近，产生克隆的FLP /首次登记税制度的可用性大大促进眼睛部分 6,9致死突变的表型分析。
眼睛部分的分析并不局限于这里所描述的切线节。如果需要的话，磁头可以在任何方向对准，在模具和横截面可研究在头层和髓质等深层。因此，这里所描述的协议是一个通用的方法对眼睛和头部结构果蝇成人的分析。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我想感谢詹妮弗柯蒂斯博士在图图片。 1，批判性阅读的手稿杰里米费根博士和佛罗伦萨马洛。我们的工作是支持由NIH资助1R01GM088202。
Materials
General equipment:
Fixation solutions:
Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax.
Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol.
Table 2. Materials |
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References
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