Yetişkin hazırlanması Drosophila Gözler İnce Kesit ve Mikroskobik Analizi

Summary

Yetişkin hazırlamak için standart bir yaklaşım

Abstract

Drosophila uzun genetik uysal olduğu kolaylığı nedeniyle, geliştirme çalışma modeli bir sistem olarak kullanılır olmuştur. Yıllar geçtikçe, mutant bir bolluk ve teknik hileler sofistike sorulan sorular ve makul bir zaman içinde cevaplanması gereken izin vermek için geliştirilmiştir. Temel fikir, bilinen tüm önemli sinyal yolakları bileşenlerinin etkileşim içine ileriye doğru elde edilen ve genetik Drosophila çalışmalar ters olmuştur. Laboratuvar koşullarında, sinekler fonksiyonel gözleri olmadan hayatta kalabilir, çünkü sinek göz, son derece iyi mutasyon analizi için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca, böcek göz yüzeyinde bir diseksiyon mikroskop altında bakıldığında düzenli, düzgün bir yüzey oluşturan yaklaşık 800 ayrı ünitesi gözleri (yönü veya ommatidia) oluşmaktadır. Sırasıyla veya genel göz boyutu, (ekranlar dayalı örnekler için; Böylece, bir mutasyon, dışarıdan pürüzsüz bir yüzey kaybı (Şekil 1 'kaba göz' fenotip) bakarak göz gelişimi ve büyümeyi etkileyebilecek olup olmadığını görmek için kolaydır dış göz morfoloji) örneğin ^1. Göz fenotipleri sonraki detaylı analizler fiksasyon, plastik gömme ve yetişkin gözleri ince kesit gerektirir.

Drosophila göz sözde göz hayali disk, (inceleme için örneğin ²⁾ larva ve pupa aşamalarında çoğalırlar ve ayırt epitel hücrelerinin bir çanta geliştirir. Dört lens salgılayan koni hücreleri, pigment hücreleri (R-hücre küme etrafında 'altıgen) ve kıl; Her ommatidium sekiz fotoreseptör (Şekil 2 PR veya R-hücreler) olmak üzere toplam 20 hücrelerinden oluşur. R8 [Şek, en kolay, ışığa duyarlı organelleri rhabdomeres (R1-6) altı "dış" ve iki "iç" fotoreseptör (R7 / 8 oluşan bir yamuk düzenlenen her ommatidium fotoreseptörlerin tespit 2]) R7 altında ve bu nedenle sadece göz derin alanlardan bölümlerinde görülmektedir. Her faset yamuk komşuları ve göz (Şekil 3A) genel bir ön-arka ve dorsoventral eksenleri ile tam uyumludur. Özellikle, dorsal ve ventral (sırasıyla siyah ve kırmızı oklar) ommatidia göz yarıları birbirlerinin ayna görüntüsü ve düzlemsel hücre polaritesi sinyalizasyon (inceleme için bakınız örneğin ³⁾ sırasında kurulan iki kiral biçimlerine karşılık gelir.

Burada anlatılan yöntemi (Şekil 3 sunulan bu gibi) yarı-ince göz bölümleri oluşturmak için başlangıçta Tomlinson ve ⁴ Hazır açıklanan biraz değiştirilmiş. Şeffaf koni hücreleri hariç tüm hücrelerin morfolojik analiz sağlar. Buna ek olarak, Ar-hücrelerinin (mavi ok uçları Şekil 2 ve 3), pigment genotip bir R-hücre için bir hücre özerk işaretleyici, böylece genlerin genetik gereksinimlerini Ar-hücrelerinin bir alt kümesi olarak kullanılabilir kolayca ^5,6 belirlenir.

Protocol

1. Fly baş diseksiyonu

1. (Jelatin kaplı slaytlar dahil) tüm malzemeler el altında olduğundan emin olun. Glutaraldehit ve Osmium fiksatif (aşağıya bakın) hazırlayın. Buz üzerinde 1,5 ml tüpler, kısım 200μl glutaraldehid düzeltme çözüm gömmek için genotip Per.
2. CO ₂ pad (genellikle bir kafası işlem sırasında yıkılmış durumda genotip başına altı gömmek için yedi sinek kafaları teşrih) sinekler anestezisi.
3. Tutun ve biraz cımbız, sinek, sırt tarafı toraks basın ve kafasını kesmek için keskin bir neşter kullanabilirsiniz.
4. Cımbız ile boyun dokunarak sinek kafası stabilize eder ve dikkatlice bir göz küçük bir bölümünü kapalı dilim. Bu fiksatif penetrasyon (klonal analizi için göz bölümleri kullanmak istiyorsanız, herhangi bir ya da daha küçük klonları ile göz kesme) artırır. Dokunarak ve sonra kesitli olacak sağlam gözün zarar kaçının.
5. Disseke başkanları, cımbız veya neşter ile kafa kesme göz yüzeyinde dokunun ve (fiksatif üst yüzer sık ​​sık başları) glutaraldehid / fosfat fiksatif içine buz üzerinde kafa transfer glutaraldehid gidermek için uzun tutulmalıdır olmamalı Osmium ek önce 15 dakikadan fazla. Aynı genotip diğer sinekler 1,2-1,5 adımları tekrarlayın.

2. Fiksasyon ve gömme (tüm adımlar için eldiven kullanın!)

1. 1 dakika 10.000 rpm'de Eppendorf santrifüj flyheads dönerler. Kafaları lavabo yoksa bile devam edin.
2. OsO ₄ çözümü 200μl ekleyin ve en az 30 dakika ve 1 saat kadar buz üzerinde düzeltmek.
3. Pasteur pipeti kullanarak, glutaraldehit / Osmium çözüm (uygun atık bertaraf işlemleri kullandığınızdan emin olun!) Kaldırın ve 200μl Osmium çözümü ile değiştirin. 1-6 saat için buz üzerinde inkübe edin. Sürekli kafaları tamamen sıvı ile kaplıdır sağlamak ve başını veya gözlerini çöküşü gibi tüm çözüm kaldırmak asla!
4. Pasteur pipeti kullanarak, fiksatif atın (etanol Osmium içerdiğinden uygun atık bertaraf işlemleri kullandığınızdan emin olun!) 0.5-1 ml% 30 etanol ve buz üzerinde en az 5 dakika inkübe ekleyin.
5. % 50,% 70 (% 80),% 90 ve iki kez% 100 etanol ile yukarıdaki adımı yineleyin. Elektron mikroskobik analizi için gözleri kullanıyorsanız% 80 etanol adım ekleyin. % 70 yıkama adımdan sonra, buz örnekleri çıkarılabilir.
6. Etanol, propilen oksit (uçucu, kaput çalışmaya devam) eşit hacmi ile değiştirin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
7. Propilen oksit yıkama tekrarlayın. Propilen oksit buharlaşma nedeniyle gözlerin çöken önlemek için paralel olarak pek çok genotipleri işlenmesi halinde gruplar halinde çalışın.
8. , Propilen oksit ve plastik bir transfer pipet kullanarak çıkarın 1:1 reçine 500μl hakkında ekleyin: propilen oksit çözüm. Oda sıcaklığında gece dengeye.

3. Kalıplara gömülmesi ve düzenlenmesi

1. Tüm kalıpları farklı genotipleri takip etmek etiketli olduğundan emin olun, sonra% 100 reçine ile kalıpları doldurun. Aşırı doldurmayın (kalıp yüzey üzerinde herhangi bir 'yüksek tepeler' düz kalıp yüzeyi boyunca) etmeyin. EM analizi için sert reçine kullanın.
2. Bir transfer pipet kullanarak, kafalar% 50 reçine çıkarmak,% 100 reçine ile değiştirin ve oda sıcaklığında 3-4 saat inkübe. Kafaları reçine ile infiltre olduğundan, tüp dibine batar.
3. Küçük bir kanca oluşturmak için bir kez sert bir zemine vurulduktan sonra bir kürdan kullanarak, bir kalıp içine anda bir kafa aktarmak.
4. Reçine dökülmelere karşı korumak için diseksiyon kapsamı çalışma alanı alüminyum folyo üzerine yerleştirin.
5. Bir diseksiyon iğnesi kullanma ve reçine kafası biraz kapsamı, girdap rağmen sivri ucu yakın ve dikkatli bir kalıp altına taşıyın.
6. Dikkatlice göz teğet yüzey kabaca yarım bir kafa tutmak için emin olun, kalıbın ön duvarı ile sağlam (!) Göz (ya da kesitler yapmak istiyorsanız gelecek kesit düzlemi) boyun yüzeyi aşağı hizalamak kalıp duvarı uzak çapı. Nadir durumlarda, göz yüzeyi ve baş kütikül arasında boş bir alan olarak görülebilir bir göz çöker. Çökmüş bir göz varsa, ^7. yedek göz ile değiştirin.
7. Tüm başkanları ile tekrarlayın. Bir kez tüm hizalanmalar ile yapılan, reçine iğne dışarı çıkardığında kıpırdamadı emin olmak için tüm gözler yeniden kontrol edin.
8. Diseksiyon iğnesi kaldırmak gözleri hareketli bir sorun varsa, istediğiniz gibi göz pozisyonu hızlı iğne başından biraz uzakta geri çekmek ve sonra yavaş yavaş iğne tamamen kaldırmak.
9. Kalıpları pişirin gecede 70 ° C.

4. Budama ve kesit

1. K, kalıpları bükme kalıpları sertleştirilmiş blokları kaldırmakblok karşılık hangi eeping izlemek için hangi genotip (örneğin küçük sintilasyon şişeleri saklamak).
2. Düzeltmek için, pleksiglas veya alüminyum bir blok yüzü yukarıya monte edilir mikrotom için uygun bir mandren kullanın. Mandreni Döşeme blok, göz, monte edin.
3. Teflon kaplı jilet kullanarak diseksiyonu kapsamı bade altında, blok sadece üst tabaka dikkatlice kesti. Bu, göz ve böylece gelecek kesit düzlemine tahmin edebilirsiniz ama net bir yüzey bırakacaktır. Parmaklarınızı kesme kaçının!
4. Başının etrafında plastik kesilir kadar başın her iki tarafında ve ön yüzünde (gözünde hizalayarak zaman üst kalıp olarak kullanılan ne yani) aşırı plastik kesiniz. Yavaş yavaş, plastikten çok ince tabakalar keserek kafa yaklaşım en iyisidir.
5. Temiz bir jilet kullanarak, dikkatli bir sonraki bölümde (genellikle göz teğet, orijinal kalıp yüzeyine hafif bir açıyla) istediğiniz tam düzlemde gözün üstüne ince tabakalar kaldırmak.
6. Sadece gözün dış yüzeyi kesip başlayana kadar devam edin. Mikrotom kolay uyum sağlayan, parlak, şeffaf yüzey elde etmek için bıçak temiz alanlarda kullanırsanız emin olun.
7. Jiletler kaydetmek için, ham blok kenarlara kırparak için büyük bıçaklar ve ince kırparak (İlk kesilen ve 4.6) için yeni bir bıçak kullanın. Sonunda gelecekteki düzlemini karşılık gelen hafif eğimli, cut-off üst üç taraflı piramit olacak.
8. Mikrotom blok monte edin. Gerçek kesit mikrotom türüne bağlı olarak değişir ve burada ayrıntılı olarak açıklanmıştır olmayacaktır. Biz 0,5 ila 1 mikrona kadar bölümleri kesmek için bir doku kalitesi elmas bıçak ile bir Sorvall MT5000 kullanın. Işık mikroskobik inceleme için kesit kalınlığı küçük farklılıklar önemli değil. Kesit klonlar Beyaz + transgen, bir bölümü tarafından işaretlenmiş 1 mikrona kadar bölümleri, bölüm başına rhabdomeres (Şekil 2) bitişik yeterli pigment granülleri sağlamak.
9. Bölüm, su üstünde yüzer. Dönen bir hareket su yüzeyinin altında bir ahşap Q-ucu düzleştirilmiş bir ucu ile ilk 20-30 bölümleri kaldırın ve bir jelatin kaplı cam slayt (yaklaşık 100 ° C'de ısıtma plakası tutulur bir damla su içine transfer .)
10. 20-30 bölümleri ile tekrarlayın. Buharlaşan su ve bölümleri slayt sopa kadar bekleyin. Genellikle, 3 gözde bölümleri bir slayt iyi uyum twp sıra üç sütun (üç gözleri) (üst / alt bölümleri) olarak düzenlenmiş.

5. Boyama ve mikroskopik analiz

1. Sürece kesit klonlar, leke bölümleri. Ayarlanmış bir ısıtma bloğu bölümleri ile koyun slayt 90 ° C 30 ml şırınga slayt üzerine 0.22μm bir filtreye bağlı bir Toluidine-mavi boyama çözüm koyun ve 10 saniye boyunca leke. Distile su ile hemen yoğun durulayın. Hava kuruması.
2. , Plastik bir transfer pipet kullanarak, slayt üzerine orta montaj DPX 3 damla dağıtmak ve bir lamel ile kaplayın. Top 3 Dimes ve montaj orta sertleşmesine izin (oda sıcaklığında örneğin gece).
3. Işık mikroskobu ile Resim. 5x yada 10x lens iyi bir bölüm bulmak ve daha sonra ayrıntılı bir analiz ve fotoğrafların 63x immersiyon yağı lens geçmek için kullanın. Biz genellikle faz kontrast ayarlarını kullanabilirsiniz, ancak karanlık alan optik olarak iyi iş görür.

6. Temsilcisi sonuçları:

En sık, göz, genetik bir ekran parçası olarak veya genel göz yapısı veya kutup etkilediği bilinen genleri ile genetik etkileşimler test sürecinde tespit edilen dış kaba göz fenotipleri ayrıntılı bir analiz için plastik gömülür. Göz bölümleri tipik sonuçlar Şekil 3'te gösterilmiştir. Wild-tip ommatidia (Şekil 3A), pigment hücrelerinin bir kafes ile çevrili tam fotoreseptör tamamlayıcı göstermektedir. Buna karşılık, bir şaşılık (stbm, nam-van-gogh ⁷⁾ mutant, ommatidial polarite tam fotoreseptör tamamlayıcı mevcut olmasına rağmen, kayıp ve rotasyon ve kiralite randomize (Şekil 3B). Ayrıca, kesitli stbm allel aw bu yana arka plan, pigment granülleri Şekil eksik. 3b. Şekil 3C, klonal bir analizin bir örneğini gösterir. Drosophila Rho kinaz (drok) ommatidial dönme yanı sıra ^göz 8 yapısal bütünlüğü için gereklidir . Vahşi mutasyon homozigot drok ² klonlar pigment hücreleri ve rhabdomeres (genellikle pigment yokluğu ile tespit edilebilir, klonlar gözsüz-FLP ve bir arka plan w tamamlayan güçlü bir şekilde ifade beyaz işaretleyici gen ile P-element kullanılarak uyarılan. tip ve heterozigot doku). Pigment eksikliği mutant alanları tespit etmek mümkün olur. R-ce pigmentasyon hücre özerklik nedeniyleLLS önce, bireysel R-hücrelerinin genotipler tespit edilebilir (Şekil 3C ok uçları görmek) bahsetti.

Şekil 1. Drosophila gözü bu yana biyologlar için mükemmel bir model sistem, yabani tip bir göz (A) pürüzsüz bir yüzey aksine, mutant bir göz yüzeyi dışarıdan sık sık, (B) kaba altında yatan göz fenotipleri göstergesi . Tüm şekil, ön sol ve dorsal kadar. Dr. Jennifer Curtiss, NMSU, Las Cruces, NM, ABD Görüntüler izniyle.

Şekil 2'de açıklanan yöntemi kullanarak kesitli tek ommatidia Işık mikroskobik görüntüler. R7 R8 üstüne yatıyor bu yana, sadece yedi R-hücrelerinin ommatidium başına bir zaman görünür. (A, A ') (R7 düzeyde, R7 hücre gövdesi R1 ​​ve R6 A sarı ok) arasında tespit edilirse'. Buna karşılık, R8 düzey (B), R8 hücre gövdesi, R1 ve R2 (B sarı ok ') arasındaki algılanır . Mavi ok uçları, bir hücre özerk pigment belirteci olarak kullanılabilir pigment granülleri işaretleyin.

Şekil 3 wild-tip (A), stbm (B) ve drok (C) mutant yetişkin Drosophila gözleri ile Teğet bölümleri. Bölümleri altında Şemalar ommatidia polarite (oklar için (A)) gösterir. Çemberleri fotoreseptör tamamlayıcı hatalarına ommatidia temsil eder. Sarı çizgiler simetri / dorsal ventral hattı (ekvator) temsil eder. Wild-tip (A) iyi odaklı ommatidia aksine, düzlemsel bir organizasyon stbm mutant (B) kaybolur . ^- Stbm mutant bölümünde gösterilen Not w nedeniyle pigment mutant arka plan yoksundur. (C) drok mutasyonlar öldürücü olduğundan, onlar klonlar analiz edilmesi gerekir. R-hücreleri eksik pigment (açık mavi ok başları) homozigot mutant Böylece, pigmentli hücreleri (dolu mavi ok başları), wild-tip veya heterozigot. Rotasyon kusurları yanı sıra, drok mutantlar da eksik veya fazla sayıda R-hücreleri de dahil olmak üzere yapısal kusurlar göstermektedir. Klonal analizi için, bölümleri pigment granülleri obscuring önlemek için lekeli olduğunu unutmayın.

Discussion

Drosophila model organizma, insanlar da dahil olmak üzere yüksek ökaryotlarda yüksek derecede korunmuş sinyal yollarının en önemli gen ailelerinin kurucu üyelerinden birçok tanımlanmasına yol açan genetik ekranları gibi kullanma. Laboratuvar koşullarında hayatta kalmak için, fonksiyonel bir gözle vazgeçilebilir olduğu için, göz, yeni genlerin fonksiyonlarının keşfi ve genetik ağlarının değerlendirilmesi için özellikle uygundur doku. Böylece açıklanan yöntemi kullanarak sinek göz ultrastrüktürel analizi geliştirme ve hastalık ile ilgili temel keşiflere yol açtı. Başlangıçta tek bir hücre klonal analiz bilinen yakından ilişkili hücre özerk resesif belirteçler ile birlikte X-ışını indüklenen klonlar kullanılarak gerçekleştirildi. Daha yakın zamanlarda, klonlar oluşturmak için FLP / FRT sistemin durumu büyük ölçüde göz ^bölümleri 6,9 ölümcül mutasyonlar fenotipik analizi kolaylaştırmıştır .

Burada açıklanan teğet bölümlerine göz bölümden Analizi sınırlı değildir. İsterseniz, kafaları kalıplarda herhangi bir yönde uyumlu hale getirilmesi ve enine bölümler lamina ve medulla gibi kafasında derin katmanları çalışma elde edilebilir. Burada açıklanan protokol bu nedenle göz ve kafa yapıları Drosophila yetişkin analizleri için çok yönlü bir yöntemdir.

Materials

General equipment: For general fly husbandry see 10 Standard dissection microscope (e.g. Nikon SMZ-645 Stereo Zoom Microscope), preferably with a ring light source to prevent casting a shadow of your hands. CO2 Fly pad, covered with 3MM Whatman paper to provide protection against dirt during dissection. Gelatin coated slides: dissolve 10g gelatin and 1g CrKSO4x 12 H2O in 1L water on a heating plate (bring almost to a boil, takes approximately 2 hrs). Dip well washed (soap) and rinsed (dH2O) slides in holders into gelatin solution and air-dry covered with foil overnight. Heating oven (70°C; old vacuum ovens that were used for nitrocellulose filter drying are well suited for this purpose). Microtome capable of ultrathin sectioning (0.5-1 μm thick sections), e.g. those used by electron microscopy facilities. We use a Sorvall MT5000 Ultramicrotome with a Histo quality diamond knife. Glass knives also work. Fixation solutions: Prepare a stock solution of 0.2 M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Prepare 2% glutaraldehyde in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2 (can be stored at 4°C for 4 weeks). Make at least enough to have 200μl per genotype you want to embed. Keep on ice. Osmium solution: 2% OsO4 in 0.1M Sodium Phosphate buffer, pH 7.2. Make only enough to have 200μl per genotype you want to embed, since the solution cannot be stored. Keep on ice. Glutaraldehyde and OsO4 are highly toxic and should be handled with extreme care in a well-ventilated hood. Use filter tips when handling OsO4 to prevent blackening of your pipette. Dehydration: Make 30%, 50%, 70%, (80%), 90%, and 100% ethanol solutions. Preferably cool 30%, 50%, 70% ethanol on ice before use. Staining solution: 1% Toluidine-blue in 1% Borax. Soft Hard Resin A 54g 50g Hardener B 44.5g 50g Accelerator C 2.5g 1.75g Plasticizer D 10g 0.75g Table 1. Resin preparation To prepare the resin, carefully, but thoroughly mix all ingredients in a plastic beaker using a magnetic stirrer with a large stir bar. Avoid bubbles. After mixing, aliquot in standard scintillation vials or similar containers and freeze at -20°C. Use soft resin for all applications unless your EM facility asks for the harder formulation. Use gloves to handle resin (carcinogenic in its unpolymerized form). To polymerize resin on equipment and waste, bake at 70°C overnight. Waste may then be safely discarded and equipment cleaned and reused. Spilled unpolymerized resin can be cleaned with isopropanol. Reagent Supplier Catalog number Fly pad e.g. Genesee 59-119 Glutaraldehyde Sigma G7526-10 X 10 ML OsO4 Polysciences,Inc. 0972A-20 Propyleneoxide Fisher 04332-1 Scalpel handles, for #3 Fisher 22080046 Scalpel blades #11 Fisher 08-916-5B Transfer pipettes Fisher 13-711-7M Durcupan (R) ACM resin Sigma (Fluka) 44610-1EA Steel dissecting needle Fisher S17346 BEEM flat embedding mold Electron Microscopy Sci. 70904-12 Teflon coated razor blades Electron Microscopy Sci. 71970 Q-tip (sterile swabs) Fisher 14-959-81 Glass slides Fisher 12-550-143 Cover slips No 1, 22X60 mm Fisher 12-531K Gelatin Fisher ICN96010280 Cr(III) K SO4 dodecahydrate Sigma 243361 Diamond Histo knife, 6mm Diatome US 60-His Toluidine Blue O Fisher BP107-10 Borax (Na-Tetraborate) Fisher AC20629-1000 DPX mounting medium Sigma 44581-100ML Table 2. Materials